宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性*

王濤，田時平，趙東，游玲，王松，馮瑞章，馮學(xué)愚，張云，崔曉龍

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)2(發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)3(云南大學(xué)省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性*

王濤1，2，田時平3，趙東4，游玲2，王松1，2，馮瑞章1，2，馮學(xué)愚2，張云1，崔曉龍3

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)2(發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)3(云南大學(xué)省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

采用純培養(yǎng)和免培養(yǎng)(culture-independent)分析方法，對宜賓多家規(guī)模以上白酒企業(yè)成熟窖泥細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)和高氏I號分離培養(yǎng)基分離細(xì)菌(包括放線菌)，并評價菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。構(gòu)建了窖泥樣品總DNA的16S rRNA基因克隆文庫。分別挑選不同培養(yǎng)特征的89株細(xì)菌純培養(yǎng)物和427個基因克隆的16S rRNA基因序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。89株純培養(yǎng)物分屬于13個屬，以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)為優(yōu)勢屬。純培養(yǎng)菌株中，具備7%濃度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分別有16株和10株。挑取的克隆子經(jīng)測序、去除嵌合體后，得到了406個有效序列，并在97%的序列相似性水平上可將其分為75個 OTU(Operational Taxonomic Unit)，分屬于 Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8 個綱。其中 Clostridia 為絕對優(yōu)勢菌群，包含50個OTU、227個克隆子;Bacilli包含11個OTU、128個克隆子，為次優(yōu)勢菌群。證明宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌群落存在豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。

濃香型白酒，窖泥，細(xì)菌，16S rRNA基因，系統(tǒng)發(fā)育多樣性

以固態(tài)泥池(窖池)發(fā)酵為典型特征的濃香型白酒是我國特有的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，其產(chǎn)量和收入均占到了我國白酒產(chǎn)業(yè)的70%以上。長期的生產(chǎn)實踐表明，窖池泥土(窖泥)中復(fù)雜的微生物群落與濃香型白酒中復(fù)雜的呈香呈味物質(zhì)形成直接相關(guān)，與產(chǎn)品質(zhì)量和酒體風(fēng)格有著十分密切的關(guān)系［1］。在濃香型白酒生產(chǎn)中，糟醅在窖池內(nèi)發(fā)酵周期長達(dá)60 d以上。通常情況下，發(fā)酵2～3周后，窖池內(nèi)就處于厭氧狀態(tài)，乙醇濃度達(dá)到5% ～6%及以上，pH值緩慢下降到3～4［2］。在長期不間斷的生產(chǎn)中，窖泥一直處于相對穩(wěn)定和特殊的生態(tài)環(huán)境中，其中的微生群落在持續(xù)且相對穩(wěn)定選擇壓下可能逐漸趨于穩(wěn)定且具備一定的特殊性。

目前對濃香型白酒窖泥微生物的研究主要涉及微生物群落組成及其變化規(guī)律、功能微生物的分離及應(yīng)用等［3－5］。盡管通過這些研究初步認(rèn)識了窖泥微生物群落，獲得了一些有用的菌株并已應(yīng)用于實際生產(chǎn)，但這些研究均存在采集的樣品較少(僅采集了一個酒廠的窖泥)、研究手段單一(僅采用了純培養(yǎng)研究方法)、研究不夠深入(許多研究僅對窖泥微生物開展了表觀形態(tài)和菌落計數(shù)研究)等問題。宜賓為中國優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的主要產(chǎn)區(qū)，對宜賓窖泥微生物群落開展系統(tǒng)的研究，既有利于指導(dǎo)行業(yè)穩(wěn)定及提高產(chǎn)品質(zhì)量，提高出酒率，還有利于進(jìn)一步正確認(rèn)識濃香型白酒發(fā)酵機理。

1 材料與方法

1.1 材料

采集了宜賓6家規(guī)模以上濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)多口窖的窖泥，采樣時間為2008年3～4月。取樣窖池使用年限均在20年以上，每口窖取窖壁上、中、下層各4點(4面窖壁)及窖底中央窖泥各100g，每個企業(yè)窖泥樣品單獨混合。

1.2 分離

采用改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)分離細(xì)菌、改良的高氏I號培養(yǎng)基分離放線菌。定期觀察分離平板，挑取單菌落劃線純化于常規(guī)NA或高氏I號斜面上。根據(jù)菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等肉眼可辯的特征去除冗余。

1.3 菌株16S rRNA基因分析

1.3.1 DNA提取、擴(kuò)增及測序

根據(jù)文獻(xiàn)［6］適當(dāng)修改，提取菌株基因組DNA、擴(kuò)增出16S rRNA基因片段。引物27f:5'－AGAGTTT-GATCTGGCTCAG－3'和1541 r:5'－AAGGAGGTGATC CAGCCGCA － 3'［7］。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)純化并測序，測序長度700－900 bp，序列已在GenBank注冊。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

所得序列用EzTaxon server 2.0［8］在線進(jìn)行相似性分析，對克隆的16S rRNA基因序列還采用Blast進(jìn)行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行比對，并用BioEdit 5.0.9進(jìn)行檢驗;采用Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbour－joining tree)的構(gòu)建、編輯與保存，序列相似值選用Kimura－2［9］計算，自舉值(bootstrap value)分析設(shè)置1000個數(shù)據(jù)樣本［10］。對聚在一條直線的菌株，通過ClustalX比對確定其序列相似度為100%后，合并成一個類群。

1.4 菌株對乙醇和低pH值耐受能力

參照文獻(xiàn)［11］的方法適當(dāng)修改，檢測菌株在7%的乙醇(V/V)和pH 4.5環(huán)境下的耐受能力。

1.5 克隆文庫構(gòu)建及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.5.1 窖泥總DNA提取和16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

采用文獻(xiàn)［12］方法適當(dāng)改進(jìn)，采用試劑盒(GENECLEAN Turbo Kits)進(jìn)行DNA純化。采用與純培養(yǎng)菌株一樣的引物，將在各個退火溫度下(52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃)擴(kuò)增的產(chǎn)物混合后用多功能純化回收試劑盒(百泰克)純化。

1.5.2 PCR產(chǎn)物克隆

用氯化鈣法制備感受態(tài)大腸桿菌，利用pMD○R19-T Vector試劑盒(寶生物)，得到PCR產(chǎn)物克隆。

1.5.3 重組子篩選及測序

用引物M13f和M13r進(jìn)行插入的16S rDNA片段檢測后，陽性克隆子送往上海生物工程有限公司(Sangon)測序。運用Mallard［13］軟件進(jìn)行嵌合體檢驗并去除嵌合體后，使用DOTUR1.53［14］軟件把序列相似性大于97%的序列劃分為同一個OTU(Operational Taxonomic Unit)［15］，并利用 Analytic Rarefaction Win v.1.3軟件(S.Holland，Stratigraphy Lab，University of Georgia，Athens;www.uga.edu/～ strata/software/)繪制稀有性曲線，根據(jù)文庫的Coverage C值確定是否補充克隆子測序。

1.5.4 序列相似性檢索

每個OTU隨機選擇1個代表序列分別通過EzT-axon server 2.0［8］和 Blast軟件在線與典型菌株16S rRNA基因和GenBank數(shù)據(jù)庫中已知有效序列進(jìn)行比對進(jìn)行相似性分析。與“1.3.2”部分相同的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

經(jīng)過菌落和細(xì)胞形態(tài)表觀去除冗余后，得到89株純培養(yǎng)菌株。對其進(jìn)行16S rRNA基因測序后，經(jīng)序列比對、相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析(表1，圖1)，發(fā)現(xiàn)89株菌與13個屬的38個種的典型菌株(未列出)序列相似性大于97%。89株菌中，屬于Streptomyces的菌株最多(39株)，其次為Bacillus(27株)，它們占到了菌株總數(shù)的74.2%。其余各屬菌株均在4株及以下，有4個屬僅分離到1株菌。

表1 純培養(yǎng)菌株的16S rRNA基因相似性分析及乙醇、pH 4.5耐受性檢測結(jié)果

89株細(xì)菌中，能夠在含有體積分?jǐn)?shù)為7%乙醇培養(yǎng)基中生長的菌株有16株(Bacillus 15株、Brevibacterium 1株);能夠耐受pH值為4.5的培養(yǎng)基的細(xì)菌有10株(Streptomyces 7株、Bacillus 3株)。其中，只有 1株與 Bacillus cereus典型菌株(ATCC 14579)16S rRNA基因相似度達(dá)99.5%的兼性厭氧菌既能耐受7%濃度的乙醇，又能耐受pH 4.5。

圖1 89株細(xì)菌與相關(guān)典型菌株構(gòu)建的基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 免培養(yǎng)法分析細(xì)菌的多樣性

共測定了427個克隆，經(jīng)檢測去除21個嵌合體序列后，406條有效序列在97%的相似度上劃分為75個OTU，文庫的Coverage C達(dá)到93.3%(文庫的稀有性曲線如圖2)，表明這些克隆代表了文庫中絕大多數(shù)細(xì)菌微生物的多樣性。EzTaxon server 2.0和Blast軟件相似性比對的結(jié)果如表2、表3(為顯示清晰，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育信息對OTU進(jìn)行了重新歸類)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。

相似性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，75個OTU分屬于Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8個綱。其中Clostridia為絕對優(yōu)勢菌群，包含50個OTU、227個克隆子(表2)，分別占OTU總數(shù)和克隆子總數(shù)的66.7%和55.9%。Bacilli包含11個OTU、128個克隆子，分別占14.7%和31.5%。其余的6個綱分別占OTU和克隆子總數(shù)的12.0%(9個OTU)和12.56%(51個克隆)(具體情況見表3)。所以從綱(Class)一級分類單位來看，Clostridia和Bacilli為優(yōu)勢菌群，且優(yōu)勢明顯。

圖2 窖泥細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫的稀缺性曲線

表2 1 50個屬于Clostridia的OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結(jié)果

續(xù)表2

表3 屬于Clostridia以外7個綱的25個OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結(jié)果

有26個OTU(231個克隆，占克隆總數(shù)的56.90%)的代表序列與對應(yīng)的典型菌株16S rRNA基因的相似度在97%以上，其中包含克隆數(shù)量處于前2位且顯著多于其他OTU的YJN51(相似度99.6%，73個克隆)和YJN31(相似度97.4%，52個克隆)，這26個OTU中克隆所代表的微生物可初步判定為對應(yīng)屬的微生物［16－17］。其中屬于 Lactobacillus屬的克隆數(shù)最多(95)，其次為Clostridium(65)，其后依次是Serratia(21)、Bacillus(21)、Streptomyces(6)、Staphylococcus(4)、Weissella(4);Oceanobacillus、Alkalibaculum、Petrimonas、sulfuriphila、Propionibacterium、Rubellimicrobium和Acinetobacte各有2個克隆，Thermus、Rhizobium和Brevundimonas各有1個克隆。其他的克隆可能均可能代表新分類單位，而且有75個克隆(分屬于20個OTU)與最接近的典型菌株16S rRNA基因的相似性在90%以下(最低的僅82.1%)，且與數(shù)據(jù)庫中最接近的序列均為Uncultured bacterium clone的序列。所以，從能夠初步確定的17個屬一級分類單位來看，Lactobacillus和Clostridium占據(jù)了絕對優(yōu)勢，同時還有176個克隆所代表的微生物代表著屬及以上分類單位的新類群。

圖3 窖泥中克隆序列與已知細(xì)菌相關(guān)序列構(gòu)建的16S基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究中，2種方法的研究結(jié)果都顯示宜賓濃香型窖泥中存在著豐富的細(xì)菌多樣性。純培養(yǎng)顯示的13個屬中，有5個屬(Rubellimicrobium、Staphylococcus、Streptomyces、Bacillus、Serratia)在免培養(yǎng)研究中被檢測到，而且盡管分屬于這5個屬的菌株高達(dá)76株(占分離菌株的84.40%)，但還有8個屬沒有在免培養(yǎng)分析結(jié)果中體現(xiàn)。而免培養(yǎng)所顯示的17個屬和大量的潛在新分類單位中，只有上述的5個屬(共54個克隆，占檢測克隆總數(shù)的13.35%)在純培養(yǎng)分析中被檢測到。其余的12個屬(含2個絕對優(yōu)勢屬)和所有的潛在新分類單位(占檢測克隆總數(shù)的86.65%)沒有在純培養(yǎng)研究結(jié)果中體現(xiàn)。這些和純培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得環(huán)境中極少一部分微生物［18］和免培養(yǎng)方法也存在一定的局限性［19］是吻合的。

純培養(yǎng)和免培養(yǎng)分析結(jié)果均顯示濃香型白酒窖池中存在抗逆性較強的芽孢(孢子)細(xì)菌，數(shù)量占絕了對優(yōu)勢。Clostridia和Bacilli 2綱中所有已知的菌株均可產(chǎn)生芽孢，而這2個綱的細(xì)菌共占了OTU總數(shù)的88.00%和克隆總數(shù)的87.44%;純培養(yǎng)菌株中，Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Rummeliibacillus 4個屬(共37株菌)可以產(chǎn)生芽孢，數(shù)量最多的為可產(chǎn)生孢子的Streptomyces屬菌株(39株菌)。同時，純培養(yǎng)菌株中能夠在7%乙醇的培養(yǎng)基和pH 4.5的培養(yǎng)基中生長的菌株分別有16株和10株。這表明，在長期不間斷生產(chǎn)所形成較高乙醇濃度、較低pH條件環(huán)境選擇下，窖泥中形成了主要種群能夠順利延續(xù)，從而保持群落相對穩(wěn)定的細(xì)菌群落。

濃香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)為乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯(其中尤以己酸乙酯最為重要)，它們主要在厭氧條件下由有機酸在酯酶的催化下與乙醇生成［1］。屬一級分類單位中，優(yōu)勢屬Lactobacillus和Clostridium分別為兼性厭氧細(xì)菌和專性厭氧細(xì)菌，表明這2個屬的菌株有在后期厭氧條件下生長繁殖的可能。Lactobacillus屬的菌株除了產(chǎn)生乳酸外，在一定條件下也會產(chǎn)生乙酸、丁酸、己酸等［20］及催化酯化反應(yīng)的酯酶［21］。而 Clostridium 屬的菌株幾乎都可以產(chǎn)生小分子有機酸。1945年就已經(jīng)報道1株Clostridium kluyveri能夠在厭氧條件下產(chǎn)生己酸、丁酸和乙酸［22］，隨后大量Clostridium屬的菌株被報道能夠產(chǎn)生包含己酸在內(nèi)的上述4種有機酸［23－25］。而本研究中與 Clostridium kluyveri典型菌株序列相似性在97.4%的OTU包含了52個克隆，在所有OTU處于第2位。這些都顯示窖泥中的主要細(xì)菌類群可能與濃香型白酒的生產(chǎn)存在著密切的關(guān)系。

濃香型白酒窖泥中存在豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，這個群落中的主要類群具備在窖泥特殊的生態(tài)環(huán)境下生長繁殖，從而保證其群落穩(wěn)定性的能力。由于濃香型白酒不同窖池之間、同一口窖池不同部位之間的微生物群存在較大差異，而且其中的微生物群落還會隨著不同季節(jié)和發(fā)酵的不同階段產(chǎn)生波動，所以要全面揭示濃香型白酒窖泥中細(xì)菌群落的多樣性及其與濃香型白酒的生產(chǎn)的關(guān)系，需要更為全面的采集樣品、采用多種方法從不同側(cè)面開展系統(tǒng)的研究。

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Bacterial Diversity of Mud Samples from Fermentation Pits of Multi-grain Strong-flavor Liquor Factories in Yibin，Sichuan Province，China

Wang Tao1，2，Tian Shi-ping3，Zhao Dong4，You Lin2，Wang Song1，2，F(xiàn)eng Rui-zhang1，2，F(xiàn)eng Xue-yu2，Zhang Yun2，Cui Xiao-long3
1(College of Life Science＆ Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China)2(Key Laboratory ofFermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin University，Yibin 644000，China)3(Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming 650091，China)4(Wuliangye Group Co.，Ltd.，Yibin 644000，China)

The aim of this study was to investigate bacterial diversity of mud samples from fermentation pits of multi-grain strong-flavor liquor factories in Yibin Sichuan province.We employed modified nutrient agar medium and Gogan-I medium for isolation and cultivation，and constructed 16S rRNA gene clone library with universal bacteriaspecific primers.Then the 16S rRNA gene sequences of the isolates and clones were analyzed，and the isolates were tested for capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Eighty-nine strains with different culture characteristics and 427 clones from sample were selected for 16S rRNA gene sequences analysis.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the 89 strains belonged to 13 genera，and Streptomyces，Bacillus are dominant genera with 39 strains and 27 strains，respectively.Four hundred and six sequences of clones(21 chimeras wiped off)were defined into 75 operational taxonomic units(OTUs)according to the 97%similarity threshold for OTU assignment by the software program DOTUR.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that these OTUs belonged to Clostridia，Bacilli，Actinobacteria，γ-Proteobacteria，α-Proteobacteria，Deinococci，Planctomycea，Bacteroidia.Clostridia and Bacilli are dominant classes with 50 OTUs(227 clones)and 11 OTUs(128 clones)，respectively.Sixteen and 10 strains of 89 strains showed the capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Bacteria of fermentation pits mud present plentiful diversity.

Multi－grain strong－flavor liquor，Pit mud，bacteria，16S rRNA gene，phylogenetic diversity

碩士研究生。

*四川省科技廳支撐計劃項目(2008NZ0031，2010NZ0029，2010NZ0091);四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2009JY0149);四川省教育廳重大培育項目(09ZZ039);四川省屬高校白酒生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)計劃資助;宜賓市科技專項研究項目(200805303、2010ZGY016)

2011－06－09，改回日期:2011－07－13