苦蕎顆粒沖劑抗氧化活性研究

馬挺軍 陜 方 賈昌喜

苦蕎顆粒沖劑抗氧化活性研究

馬挺軍1陜 方2賈昌喜1

(北京農(nóng)學院食品科學學院1，北京 102206)
(山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所2，太原 030031)

研究苦蕎顆粒沖劑(TBPM)對D－半乳糖誘導衰老小鼠氧化應激狀態(tài)的影響及其作用機理。將健康的昆明雄小鼠隨機分為對照組、模型組、和苦蕎顆粒沖劑1號低、中、高3個劑量組與苦蕎顆粒沖劑2號中劑量組。飼養(yǎng)6周后，測定不同劑量苦蕎顆粒沖劑對小鼠抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量的影響。結(jié)果表明，攝入苦蕎顆粒沖劑2號后小鼠血清和肝臟中的SOD酶活顯著增加(P＜0．01)，肝臟GSH－px活力增加(P＜0．001);攝入苦蕎顆粒沖劑1號高劑量后小鼠肝臟中丙二醛的含量減少，血清和肝臟中SOD酶活顯著增加(P＜0．05)?？嗍w顆粒沖劑具有一定的抗氧化活性。

苦蕎顆粒沖劑 抗氧化 D－半乳糖

苦蕎(Fagopyrum tataricum(Linn)Gaench)又稱野蕎麥，蓼科蕎麥屬一年生草本植物，種子供食用或作飼料。蕎麥含有多種營養(yǎng)成分，如高活性蛋白、高活性膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)含量較高且結(jié)構(gòu)合理，同時，蕎麥富含生物類黃酮(Flavonoid)、糖醇(Fagopyritol)、D－手性肌醇(D －chiro－inositol)、花青素(Anthocyanidin)等功能成分。這些成分結(jié)構(gòu)明確、含量豐富，在抗腫瘤、抗氧化和清除自由基、防治心腦血管疾病，調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓等方面效果顯著［1－3］?？嗍w葉、殼提取物對脂質(zhì)的過氧化具有較強的抑制作用，并且對羥自由基和超氧陰離子均有較強的清除能力，能強烈抑制大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化物丙二醛的產(chǎn)生［4－9］。蕎麥獨特的營養(yǎng)保健功能使之成為現(xiàn)代臨床營養(yǎng)學最具影響力的糧食資源之一。本試驗以苦蕎麥為原料制備顆粒沖劑，研究該食品對D－半乳糖誘導衰老小鼠抗氧化作用，為進一步開發(fā)苦蕎功能食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 受試物及主要試劑

苦蕎顆粒沖劑(TBPM):1號、2號各一袋，各500 g，褐色顆粒狀固體，由山西農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所提供，使用時研碎，用蒸餾水分別配制成0．07、0．13 及 0．27 g/mL，4 ℃保存。

D － 半乳糖:Amresco 0637，100 g/瓶，北京楚和霞光生物技術(shù)發(fā)展中心，使用時用生理鹽水配制成10 mg/mL溶液，4℃保存;維生素 E(油):批號為W0019，純度≥98%，25 g/瓶，使用時用大豆油稀釋成0．83 mg/mL溶液，4℃避光保存;

乙酰膽堿酯酶(TChE)測試盒、單胺氧化酶(MAO)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽－過氧化物酶(GSH－px)測試盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1．2 試驗儀器

電子恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;UV－1601PC型可見紫外分光光度計:日本Shimadzu公司;ULTRA－TURRAX T25高速組織勻漿機:德國IKA實驗室設備公司。

1．3 苦蕎顆粒沖劑的制備

按8∶1∶1比例稱取苦蕎麩皮細粉、燕麥麩皮細粉、輔劑糊精及糖醇添加物，混合均勻，其中1號沖劑燕麥經(jīng)脫脂處理;加入65%的醫(yī)藥乙醇將混合好的原料制成適宜軟材，再經(jīng)20目的篩網(wǎng)振蕩搓壓過篩，制成濕顆粒;濕顆粒于60℃烘干，分裝。

1．4 一般營養(yǎng)成分的測定［10］

粗蛋白:凱氏定氮法;水分:常壓干燥法;灰分:重量法;纖維:酸水解法;脂肪:索氏抽提法。

1．5 試驗動物

SPF級昆明種小鼠77只，♂，(20±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2007－0001，各組小鼠購入后于SPF級動物實驗室適應3 d后開始試驗。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，室溫控制在23～26℃，濕度控制在(60±2)%，14 h照明，10 h黑暗。

1．6 動物飼養(yǎng)及D－半乳糖衰老模型的建立

77只小鼠按體重隨機分為7組:苦蕎顆粒1號低、中、高3 個劑量組［2、4、8 g/(kg·d)］，苦蕎顆粒2號一個劑量組4 g/(kg·d)，并設一個空白對照組和一個模型對照組及陽性對照組(維生素 E，25 g/(kg·d))，各組每天皮下注射D－半乳糖溶液(100 mg/kg)造模，正常對照組每天皮下注射生理鹽水。同時各劑量組灌胃給予不同濃度受試樣品，模型對照組和正常組灌胃給予同體積溶劑，陽性對照組灌胃給予維生素E溶液，每天給藥1次，連續(xù)給藥6周后觀察各組小鼠形態(tài)學變化及新環(huán)境中行為，并在最后一次給藥后第2天摘眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離出血清測定其丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽－過氧化物酶(GSH－px)活性。小鼠取血后斷頭處死，立即取腦及肝臟(在冰面進行)，制備10%組織勻漿，測定腦中乙酰膽堿酯酶(TChE)及單胺氧化酶(MAO)活性，肝臟中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽－過氧化物酶(GSH－px)活性，組織蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭法。

1．7 新環(huán)境中行為的觀察

將每只小鼠單獨放于大號籠子中，記錄1 min內(nèi)小鼠后腿站立和理毛次數(shù)，比較各組小鼠在新環(huán)境中自發(fā)行為表現(xiàn)的差異。

1．8 10%組織勻漿制備及指標測定

取組織塊(肝臟取0．5 g左右，均取同一部位，腦取全部)，用冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入10 mL的帶蓋離心管中，剪碎，加入9倍體積的預冷的生理鹽水，將離心管放入裝有冰水混合物的小燒杯中，用高速組織勻漿機勻漿后，4℃，3 000 r/min離心10 min。將離心好的勻漿留上清液棄沉淀，根據(jù)預試結(jié)果取最佳濃度進行測定。各項指標測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體操作步驟見說明書。由于樣本量眾多，故血清及組織勻漿制備后立即于－20℃凍存。

1．9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以mean±S．E．M．來表示，結(jié)果采用Stat View(SASSystem for Windows V8)軟件進行ANOVA Procedure Dunnett's t檢驗和方差分析，并以LSD法進行組間的比較。

2 結(jié)果分析

2．1 TBPM對小鼠在新環(huán)境中行為的觀察

與正常對照組比較，模型對照組小鼠1 min內(nèi)后腿站立次數(shù)明顯減少(P＜0．001)，陽性對照組與模型對照組比較1 min內(nèi)后腿站立次數(shù)顯著增加(P＜0．05)，而各TBPM藥劑量組1 min內(nèi)小鼠后腿站立次數(shù)與模型對照組比較均無顯著性差異(見表1)。

表1 TBPM對D－半乳糖衰老模型小鼠在新環(huán)境中行為的影響(珋x±s，n=11)

2．2 TBPM對腦中乙酰膽堿酯酶(TChE)及單胺氧化酶(MAO)活性影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠大腦TChE及 MAO 活性顯著升高(P ＜0．001，P ＜0．05)，說明模型成功。陽性對照組與模型對照組比較大腦TChE及 MAO活性顯著降低(P ＜0．05，P ＜0．001)，而各TBPM給藥劑量組則未見大腦TChE及MAO活性降低(見表2)。

表2 TBPM對D－半乳糖衰老模型小鼠大腦中TChE及 MAO 活性的影響(x－ ±s，n=11)

2．3 TBPM對MDA水平的影響

由表3可見，肝臟中:模型對照組與正常對照組比較，MDA水平顯著升高(P＜0．05)，陽性對照組及TBPM 1號高劑量組小鼠肝臟中MDA水平則明顯降低(P ＜0．001、P ＜0．05)。

表3 TBPM對D－半乳糖衰老模型小鼠肝臟及血清中MDA水平、SOD及GSH－px活性的影響(珋x±s，n=11)

血清中:模型對照組比正常對照組血清MDA水平顯著升高(P＜0．05)，陽性對照組則能顯著降低其MDA水平(P＜0．05)，而各TBPM給藥劑量組與模型對照組比較，均未見血清MDA水平顯著降低。

2．4 TBPM對SOD活性的影響

由表3可見，肝臟中:模型對照組SOD活性與正常對照組比較顯著降低(P＜0．01)，陽性對照組與模型對照組比較其 SOD活性顯著升高(P＜0．01)。TBPM 1號高劑量組及TBPM 2號中劑量組SOD活性均顯著性升高(P ＜0．05，P ＜0．05，P ＜0．01)。

血清中:模型對照組血清SOD活性與正常對照組比較顯著降低(P＜0．01)，陽性對照組、TBPM 1號低劑量組、高劑量組及TBPM 2號中劑量組其血清SOD活性均顯著性升高(P ＜0．01，P ＜0．01，P ＜0．05，P ＜0．01)。

2．5 TBPM對GSH－PX活性的影響

由表3可見，肝臟中:模型對照組與正常對照組比較，GSH－px活性顯著降低(P＜0．01)，陽性對照組、TBPM 1號低劑量組及TBPM 2號中劑量組均可見 GSH －px活性顯著升高(P ＜0．05，P ＜0．01，P ＜0．001)。

血清中:模型對照組與正常對照組比較GSH－px活性顯著降低(P＜0．001)，陽性對照組則能顯著升高其血清GSH－px活性(P＜0．001)，而各TBPM給藥劑量組未見血清GSH－px活性升高。

2．6 TBPM的營養(yǎng)成分分析

動物試驗所用的TBPM主要營養(yǎng)成分見表4，其中2號多糖、糖醇的含量均較高，蕎麥糖醇為0．8% 。

表4 TBPM主要營養(yǎng)成分含量/%

3 討論與結(jié)論

D － 半乳糖可引起細胞和機體的衰老［11－12］，致小鼠亞急性衰老模型衰老變化明顯，模型穩(wěn)定。體內(nèi)產(chǎn)生SOD、GSH－px活性間接反映機體清除氧自由基的能力，而MDA水平高低間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度。模型對照組與正常對照組比較各項指標均具有顯著性差異，說明模型建立成功，而陽性藥維生素E也顯示出抗氧化作用。

TBPM 1號及2號給藥組與模型對照組比較，TBPM 1號高劑量組表現(xiàn)出降低肝臟MDA水平、升高肝臟及血清中SOD活性的作用;TBPM 2號中劑量組顯示升高肝臟及血清中SOD以及肝臟中GSH－px活性作用，因此TBPM 1號及2號均表現(xiàn)出了一定的抗氧化作用。從TBPM 1號及2號營養(yǎng)成分表說明配方差別不大，TBPM 2號多糖、糖醇的含量均較高，蕎麥糖醇為0．8%，不是影響TBPM抗氧化的主要成分。

TBPM 1號和2號給藥劑量組對小鼠新環(huán)境中行為指標、腦中TChE、MAO活性均未見顯著影響，說明TBPM雖可提高抗氧化系統(tǒng)機能，減少自由基及脂質(zhì)過氧化物的生成，但沒有減輕自由基及脂質(zhì)過氧化物對神經(jīng)細胞的損傷，對膽堿能系統(tǒng)乙酰膽堿酯酶(TChE)，單胺能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)單胺氧化酶(MAO)活性沒有抑制，具體原因有待進一步的研究。

研究表明，連續(xù)6周服用TBPM 1號、2號可以有效對抗D－半乳糖所致的小鼠亞急性衰老，具有抗氧化作用。其抗氧化的機制可能是通過提高機體SOD、GSH－px等抗氧化酶活力，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，從而對抗自由基對細胞的損傷。TBPM有望成為一種長期食用的方便保健食品。

［1］Fabjan N，Rode J，Kosir I J，et al．Tartary buckwheat(Fagopyrum tataricum Gaertn．)as a source of dietary rutin and quercitrin［J］．J．Agric Food Chem，2003，51(22):6452 －6455

［2］陜方，李文德，林汝法，等．苦蕎不同提取物對糖尿病模型大鼠血糖的影響［J］．中國食品學報，2006，6(1):208 －211

［3］Ren W，Qiao Z，Wang H，et al．Tartary buckwheat flavonoid activates caspase 3 and induces HL － 60 cell apoptosis［J］．Methods and Exp Clin Pharmacol，2001，23(8):370

［4］王敏，魏益民，高錦明．苦蕎麥總黃酮對高脂血大鼠血脂和抗氧化作用的影響［J］．營養(yǎng)學報，2006，28(6):502－509

［5］王敏，魏益民，高錦明．苦蕎黃酮的抗脂質(zhì)過氧化和紅細胞保護作用研究［J］．中國食品學報，2006，28(1):278－282

［6］劉淑梅，韓淑英，張寶忠，等．蕎麥種子總黃酮對糖尿病高脂血癥大鼠血脂、血糖及脂質(zhì)過氧化的影響［J］．中成藥，2003，25(8):662 －663

［7］張民．苦蕎殼提取物抗氧化活性研究［J］．食品科學，2004，25(10):312 －314

［8］Holasova M，F(xiàn)iedlerova V，Smrcinova H，et a1．Buckwheatthe source of antioxidant activity in functional foods［J］．Food Research International，2002，35(2):207 －211

［9］Sun T，Chi T H．Antioxidant Activities of Buckwheat Extracts［J］．Food Chemistry，2005，90(4):743 －749

［10］黃偉坤．食品檢驗與分析［M］．北京:中國輕工業(yè)出版社，1989

［11］Cui X，Zuo P．Chronic systemic D － galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice:protective effects of R －alpha－lipoic acid［J］．J Neuro sci Res，2006，83:1584 －1590

［12］Long J G，Wang X M，Gao H X，et al．D － galactose toxicity in mice is associated with mitochondrial dys－function:protecting effects of mitochondrial nutrient R－alpha－lipoic acid［J］．Biogerontology，2007，8:373 －381．

Study on Antioxidation Effects of Tartary Buckwheat Power Medicine on the D－gal Induced Aged Mice

Ma Tingjun1Shan Fang2Jia Changxi1
(College of Food Science，Beijing Agricultural College1，Beijing 102206)
(Institute of Farm Products Comprehensive Utilization，Shanxi Academy of Agricultural Sciences2，Taiyuan 030031)

To study the antioxidant effect of tartary buckwheat power medicine(TBPM)，the effect and mecha-nism of TBPM on oxidation were investigated by using D －galactose induced aged mice．Male KM mice(77)were divided into seven groups，saying the control group，the model group，three dosage groups with low，middle and high TBPM 1#，and the dosage group with TBPM 2#．After being fed respectively for six weeks，the effect of the different dosage of TBPM on antioxidation enzyme activity and malondialdehyde content of the mice were determined．The results showed that the intaking of TBPM Sample 2 significantly enhanced the activities of SOD in serum and liver(P＜0．01)and GSH －px in liver(P ＜0．001)for the mice;the intaking of Sample 1 reduced liver malondialdehyde amount and enhanced the activities of SOD in serum and liver(P ＜0．05)．It is demonstrated that TBPM has remarkable antioxidation effects on aged mice．

Tartary buckwheat power medicine，antioxidation，D － galactose

R587．1

A

1003－0174(2011)07－0099－04

“十一五”國家科技支撐計劃(2006BAD02B06)，北京市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點建設學科項目(PXM 2009_014207_078172)，北京市科技新星項目(2007 B030)

2010－08－25

馬挺軍，男，1973年出生，博士，副教授，天然產(chǎn)物提取與利用

賈昌喜，男，1956年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工