鱖魚(yú)與鰱魚(yú)肌球蛋白輕鏈2啟動(dòng)子的克隆及其序列比較分析

趙發(fā)蘭,周瑞雪,成 嘉，陳敦學(xué)，農(nóng)小獻(xiàn)，蒙 濤,張建社,褚武英

(1.長(zhǎng)沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410003；2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 桂林 541004)

不同魚(yú)類(lèi)由于所處的地理環(huán)境和食性不同，使其在肌肉相關(guān)性狀等方面存在較大的差異．近年來(lái)，為了探明不同魚(yú)類(lèi)的肉質(zhì)差異及其形成的原因，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究和對(duì)比．隨著研究的深入，人們已經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到這些差異是相關(guān)基因差異表達(dá)的結(jié)果[1-5]．對(duì)這些基因差異表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還處于起步階段．啟動(dòng)子是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件，含有基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要信息，很大程度上決定了基因表達(dá)的強(qiáng)度以及特異性[6-8]．因此，分析和認(rèn)識(shí)差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于從理論上揭示基因差異表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并將其應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因和育種工程等領(lǐng)域，對(duì)于闡明重要肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制等生命過(guò)程具有重要意義．

目前青、草、鰱、鳙、鯉和鯽魚(yú)等常規(guī)魚(yú)既是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主體產(chǎn)業(yè)，又是我國(guó)水產(chǎn)品市場(chǎng)供應(yīng)的主導(dǎo)產(chǎn)品，其產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 70% 以上．但是，與鱖魚(yú)、黃鱔、黃顙等淡水優(yōu)質(zhì)魚(yú)相比，這些常規(guī)品種在其肉品質(zhì)上還不能完全滿足消費(fèi)者的需求．如何在保證常規(guī)淡水魚(yú)產(chǎn)量同時(shí)不斷提高其肉品質(zhì)是目前最關(guān)注的問(wèn)題之一，對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定健康發(fā)展具有重要意義[9-11]．因此克隆鱖魚(yú)與鰱魚(yú)肌肉組織差異表達(dá)重要功能基因MLC2的啟動(dòng)子，分析和比較兩啟動(dòng)子的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將有助于從理論上揭示基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)和品質(zhì)性狀形成的分子機(jī)理．

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活鱖魚(yú)和鰱魚(yú)購(gòu)于長(zhǎng)沙毛家橋水產(chǎn)市場(chǎng)，解剖取肝臟新鮮組織用于基因組總DNA的提取．

1.2 基因組總DNA的提取

消化過(guò)夜后采用V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1的混合液抽提基因組總DNA．0.01 g/mL瓊脂糖凝膠(全文濃度相同)電泳檢測(cè)其質(zhì)量，測(cè)定吸光度檢測(cè)其純度．

1.3 PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及分析

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表文章中斑馬魚(yú)肌球蛋白啟動(dòng)子和金頭鯛啟動(dòng)子序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成.其序列如下：

鱖魚(yú)啟動(dòng)子 上游引物：5′-TGGAGTTCGGTGGGTGGGTT-3′

下游引物：5′-TGTCTCCTGCTGCCTGCCTC-3′

鰱魚(yú)啟動(dòng)子上游引物：5′-CGACGGACGGAGGAGAACGTG-3′

下游引物：5′-CTGCCTGCCTCCTCTTGGCCTTCTT-3′

用普通高效Taq酶擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×buffer，2.5 μL；dNTP(10 mmol/L)，1 μL；Sense-Primer(10 μmol/L)，1 μL；Anti-sense Primer(10 μmol/L)，1 μL；模板(DNA)，1 μL；Ex.Taq，0.2 μL；用雙蒸水補(bǔ)齊 25 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃變性 5 min；94 ℃變性 30 sec，56 ℃ 退火 30 sec，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃，延伸 10 min，4 ℃保溫．所擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析其純度．然后根據(jù)Promega純化試劑盒割膠回收后，依據(jù)pGEM-T Easy 載體試劑盒(Tiangen)說(shuō)明書(shū)連接過(guò)夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取10 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色單菌斑培養(yǎng)，菌液經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增，電泳分析，確定插入片段是否正確．將篩選出的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行序列測(cè)定．

1.4 5′上游調(diào)控區(qū)的分析

將鱖魚(yú)與鰱魚(yú)MLC2基因 5′端上游調(diào)控區(qū)序列序列經(jīng)Matlnspector在線軟件并利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度檢驗(yàn)與定量

取5.0 μL DNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢查其質(zhì)量，如圖1所示．測(cè)定所得樣品DNA吸光度，計(jì)算A260/A280值，取比值為1.8～2.0之間的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)．

2.2 5′ 端上游調(diào)控區(qū)的PCR結(jié)果

取5.0 μL DNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的質(zhì)量和驗(yàn)證是否所需目的條帶.以鱖魚(yú)和鰱魚(yú)DNA為模板擴(kuò)增條帶區(qū)分別顯示約為900 bp，與預(yù)期PCR片段長(zhǎng)度相似，其PCR結(jié)果的電泳圖譜如圖2所示．

1.鱖魚(yú)DNA，2.鰱魚(yú)DNA 1.M100 bp ladder,2.鱖魚(yú)，3.鰱魚(yú)圖1 鰱魚(yú)與鱖魚(yú)DNA電泳結(jié)果 圖2 鱖魚(yú)鰱魚(yú)啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果

2.3 5′端上游調(diào)控區(qū)的測(cè)序

測(cè)序得到鱖魚(yú)MLC2啟動(dòng)子序列長(zhǎng)890 bp，鰱魚(yú)MLC2啟動(dòng)子序列長(zhǎng)869 bp．通過(guò)序列分析兩種魚(yú)類(lèi)的特異性結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鱖魚(yú)分別在-38 bp、-378 bp、-517 bp處含有3個(gè)MEF2結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，相似性為90%，還有5個(gè)E-box結(jié)合位點(diǎn)，鰱魚(yú)只在-53 bp含有一個(gè)MEF2結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，E-box結(jié)合位點(diǎn)同樣含有5個(gè)，如圖3a,b所示．

圖3a鱖魚(yú)MLC 2啟動(dòng)子核苷酸序列

圖3b鰱魚(yú)MLC2啟動(dòng)子核苷酸序列

注：序列下畫(huà)“ ”表示-CANNTG-；灰色部分表示起始密碼子；黑體表示TATA-box，“ ”表示(C/T)TA[T/A]4TA(G/A)

2.4 序列分析

利用Primer Premier 5.0軟件對(duì)測(cè)出的5′ 端上游調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行Motif預(yù)測(cè)和經(jīng)Matlnspector在線軟件分析，得出鱖魚(yú)鰱魚(yú)MLC2啟動(dòng)子部分均含有1個(gè)TATA-box、CAAT-box，鱖魚(yú)含有2個(gè)Glycol結(jié)構(gòu)，而鰱魚(yú)含此結(jié)構(gòu)為4個(gè)(如表1)．

獲得的鱖魚(yú)和鰱魚(yú)MLC2基因啟動(dòng)子序列與已經(jīng)報(bào)道的金頭鯛、斑馬魚(yú) MLC2啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的比較如圖4所示．鱖魚(yú)、鰱魚(yú)均含有5個(gè)E-box，金頭鯛與斑馬魚(yú)分別含有6個(gè)和4個(gè)．斑馬魚(yú)與鱖魚(yú)啟動(dòng)子序列含有3個(gè)MEF2結(jié)合位點(diǎn)，金頭鯛啟動(dòng)子包含4個(gè)MEF2結(jié)合位點(diǎn)，而鰱魚(yú)啟動(dòng)子僅含有1個(gè)MEF結(jié)合位點(diǎn)，4種魚(yú)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的位置均有所不同．

表1 Primer Premier 5.0對(duì)5′ 端上游調(diào)控區(qū)序列的預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 鱖魚(yú)、鰱魚(yú)、金頭鯛及斑馬魚(yú)MLC2基因啟動(dòng)子中E-box、 TATA和MEF2的示意圖

3 討論

對(duì)人類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等多個(gè)物種的MLC2基因及啟動(dòng)子研究的結(jié)果顯示，MLC2基因5′側(cè)翼區(qū)以及 5′非翻譯區(qū)是保持高水平轉(zhuǎn)錄活性所必需的序列[12-13]．脊椎動(dòng)物中許多骨骼肌肉特異性基因的轉(zhuǎn)錄均需要MEF2和與bHLH (basic helix-loop-helix protein，bH LH protein)MyoD等因子基因相互結(jié)合作用從而導(dǎo)致肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活與生成，其中bHLH常與E-box(CANNTG)這樣的六核苷酸相結(jié)合．MLC2啟動(dòng)子包含典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)E-box(CANNTG)和 TATA-box序列以及進(jìn)化保守的MEF2結(jié)合位點(diǎn)，即(C/T)TA[T /A]4TA(G/A)序列[14-15]．比較金頭鯛和斑馬魚(yú)MLC2f的啟動(dòng)子基因發(fā)現(xiàn)E-box和MEF2結(jié)合位點(diǎn)在基因序列上存在的位置不同．金頭鯛和斑馬魚(yú)MLC2f啟動(dòng)子起始位點(diǎn)的近端MEF2結(jié)合位點(diǎn)與TATA-box之間的距離分別為15 bp和17 bp，作者所得到的鱖魚(yú)和鰱魚(yú)MEF2結(jié)合位點(diǎn)和TATA-box距離起始位點(diǎn)分別為28 bp和21 bp．有研究顯示肌肉順式作用元件具體轉(zhuǎn)錄位于近啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)幾百堿基，金頭鯛MLC2f在5′端的650 bp存在這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)，作者所得鱖魚(yú)和鰱魚(yú)MLC2啟動(dòng)子序列在800 bp以內(nèi)存在相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)．

不同長(zhǎng)度的MLC2啟動(dòng)調(diào)控序列具有不同的啟動(dòng)活性．Amold H.H.等研究分析斑馬魚(yú)MLC2f啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)在近起始位點(diǎn)包含MEF2結(jié)合位點(diǎn) 79 bp能夠激活氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因的表達(dá)，其功能相當(dāng)于長(zhǎng)度3 kb 啟動(dòng)子[16-17]，說(shuō)明MEF2結(jié)合位點(diǎn)在斑馬魚(yú)肌肉細(xì)胞中起著十分重要的作用．Funkenstein B等人通過(guò)體外注射質(zhì)粒DNA的方法研究金頭鯛的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，大約244 bp 包含1個(gè)TATA box 和2個(gè)MEF2 結(jié)合位點(diǎn)亦能有效地引起熒光素報(bào)告基因的表達(dá)[18-19]．分析作者得到的鱖魚(yú)MLC2啟動(dòng)子序列在起始密碼子上游309 bp包含TATA box和2個(gè)MEF2 結(jié)合位點(diǎn)，而在鰱魚(yú)序列相應(yīng)的部分只包含TATA box一個(gè)MEF2 結(jié)合位點(diǎn)，因此作者推測(cè)鱖魚(yú)約309 bp MLC2啟動(dòng)子要比鰱魚(yú)相同長(zhǎng)度的MLC2啟動(dòng)子更為高效，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明．此外，軟件分析鱖魚(yú)鰱魚(yú)在650～900 kb的啟動(dòng)序列表明在序列中還包含有更多的結(jié)合位點(diǎn)，關(guān)于這些結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能與機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究．

參考文獻(xiàn)：

[1] DEVOTO S H，MDLANCON E，EISEN J S，etal.Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo prior to somite formation[J]．Development，1996，122：3371-3380．

[2] CHAUVIGNE F,CAUTY C,RALLIERE C,etal.Muscle fiber differentiation in fish embryos as shown by in situ hybridization of a large repertoire of muscle-specific transcripts[J].Dev Dyn,2005,233: 659-666.

[3] WEEDS A G,LOWEY S.Substructure of the myosinmolecule(Ⅱ.The light chains of myosin)[J].J Molec Biol,1971,61:701-725.

[4] NABESHIMA Y，F(xiàn)UJII-KURIYAMA Y，MURAMATSU M，etal.Molecular cloning and nucleotide sequences of the complementary DNAs to chicken skeletal muscle myosin two alkali light chain mRNAs[J].Nucleic Acids Res,1982,10: 6099-6110.

[5] YAMANO K,TAKANO-OHMURO H,OBINATA T,etal.Effect of thyroid hormone on developmental transition of myosin light chains during flounder metamorphosis[J].Gen Comp Endocrinol,1994(93):321-326.

[6] 蒙 濤,褚武英,張建社,等.鱖肌肉組織cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其ESTs分析[J]．淡水漁業(yè),2009(39):27-33.

[7] FUNKENSTEIN B，SKOPAL T，RAPOPORT B，etal.Characterization and function alanalysis of the 5′ flanking region of myosin light chain-2 gene expressed in white muscle of the gilthead sea bream(Sparusaurata)[J].Comp Biochem Physiol，2007(2):187-199.

[8] ZHANG J S,FU G H,CHU W Y,etal.cDNA Cloning and expression analysis of the myosin heavy chain (MYH) gene of the mandarin fish Siniperca kneri[J].Aquac Res,2009,40(4): 412-418.

[9] CHU W Y,FU G H,MENG T,ZHANG J S,etal.Gene expression profiling in muscle tissues of the commercially important teleost,SinipercachuatsiL[J].Aquac Int,2010，18: 667-678.

[10] AMOLD H H，WINTER B.Muscle differentiation：more complexity to the network of myogenci regulator[J].Curr Opin Genet Dev，1998，8：539-545．

[11] 李池陶，關(guān)海紅，胡雪松,等.大頭鯉、黑龍江鯉、德國(guó)鏡鯉及其雜種F3肌肉品質(zhì)的比較[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2008，32(1)：45-50.

[12] 張建社,周瑞雪,褚武英,等.大眼鱖和斑鱖肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(34)：15022-15026.

[13] TANG Jian-zhou，ZHANG Dong-yi，CHENG Jia,etal.Comparative analysis of the proteomic profile of the muscle proteins from two teleosts,the Chinese madarine fish and silver carp[J].J Fisheries China，2007(3): 361-368.

[14] ZHOU R X,CHU W Y,ZHANG J S,etal.Selection of reference genes in transcription analysis of gene expression from the mandarin fishSinipercachuasti[J].Zoo Reas,2010,31(2):141-146.

[15] HUANG C J,TU C T,TSAI H J.Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of Zebrafish[J].Dev Dyn,2003,228:30-40.

[16] XU Y,HE J,TIAN H L,etal.Fast skeletal muscle-specific expression of a zebrafish myosin light chain 2 gene and characterization of its promoter by directin jection into skeletal muscle[J].DNA Cell Biol,1999,18:85-95.

[17] 周瑞雪,褚武英,張建社,等.鱖魚(yú)肌球蛋白輕鏈2基因cDNA的克隆及其發(fā)育性表達(dá)[J]．湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2009，32(3):78-83.

[18] 張建社,夏新界,褚武英,等.基于異源cDNA基因芯片雜交的鱖魚(yú)肌肉組織基因表達(dá)譜初步分析[J]．水生生物學(xué)報(bào),2009,33(1):46-53.

[19] MOUTOU K A,CANARIO A V,MAMURIS Z,etal.Molecular cloning and sequence ofSparusaurataskeletal myosin light chains expressed in white muscle: developmental expression and thyroid regulation[J].J Exp Biol,2001,204(17): 3009-3018.