密枝瑚菌多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

蘇鳳賢，楊全文，李彩霞，李 鵬

河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，張掖734000

密枝瑚菌多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

蘇鳳賢，楊全文，李彩霞，李 鵬

河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，張掖734000

本文對(duì)密枝瑚菌多糖的測(cè)定方法和提取工藝參數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，采用硫酸苯酚法測(cè)定密枝瑚菌多糖方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好。在此基礎(chǔ)上采取單因素實(shí)驗(yàn)和正交分析，得到密枝瑚菌多糖最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶20，提取時(shí)間3 h，提取溫度90℃。在此條件下，多糖提取率為2.23%。

密枝瑚菌;多糖;提取工藝參數(shù)

密枝瑚菌(Ramaria stricta(Pers.∶Fr.)Quél.)別名密叢枝，是一類群生于闊葉樹的腐木或枝條上的子實(shí)體中等大小的真菌，屬非褶菌目(Aphyllophorales)枝瑚菌科(Ramariaceae)。該科各屬含有很多質(zhì)地脆嫩、別具風(fēng)味的食用菌，是我國(guó)野生食用菌資源中不可忽視的組成部分［1］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，密枝瑚菌與森林的關(guān)系極為密切，具有風(fēng)味好、個(gè)體大、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，在商業(yè)上極具開發(fā)價(jià)值［2］。密枝瑚菌菌肉白或淡黃色、內(nèi)實(shí)，主要分布于山西、黑龍江、吉林、安徽、海南、西藏、四川、河北、廣東、云南等地。目前有報(bào)導(dǎo)金黃枝瑚菌、紅枝瑚菌和黃枝瑚菌對(duì)小白鼠肉瘤(S-180)和艾氏癌(EC)有較強(qiáng)的抑制作用［3］，但未見有密枝瑚菌研究報(bào)道。食用菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，近年來國(guó)內(nèi)外已對(duì)多種食用菌進(jìn)行了多糖的提取純化、分離鑒定及功能性研究，靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖等已用于臨床［4-8］，食用菌多糖在抗腫瘤、抗衰老、降血糖方面顯示出誘人前景。本文采取硫酸-苯酚法對(duì)密枝瑚菌多糖的測(cè)定方法和提取工藝進(jìn)行了初步研究，為建立密枝瑚菌多糖科學(xué)的測(cè)定方法及經(jīng)濟(jì)的制備工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2004年采自張掖市肅南縣東柳溝，通過查閱中國(guó)大型真菌鑒定屬于非(或無)褶菌目枝瑚菌科密枝瑚菌(Ramaria stricta(Pers.∶Fr.)Quél.)［1］。

1.1.2 試劑

葡萄糖﹑乙醇(95%)、濃硫酸﹑苯酚、丙酮、乙醚、H2O2、三氯甲烷、正丁醇，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司); DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽;LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造);電子天平(Mettler Toledo，0.01 mg/200 g)。

1.3 方法

1.3.1 密枝瑚菌多糖的提取

準(zhǔn)確稱取0.50 g，經(jīng)干燥、粉碎、過20目篩的密枝瑚菌粉，置于100 mL錐形瓶中，按料液比1∶20量加入蒸餾水，于恒溫水浴鍋中恒溫提取，浸提完畢后立即冷卻，于4000 r/min離心10 min，取上清液，緩慢加入3倍體積的95%乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜;然后在4000 r/min離心5 min，收集沉淀，依次用80%的乙醇、95%乙醇、乙醚反復(fù)洗滌，再于3000 r/ min離心5 min，所得即為密枝瑚菌多糖粗提物，用蒸餾水溶解備用。

1.3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液按硫酸－苯酚法［9］進(jìn)行顯色，然后在400～600 nm測(cè)定吸光度以確定最大吸收波長(zhǎng)λmax。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，配制成含葡萄糖100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取定量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其分別與6% 重蒸苯酚混合，再快速加入濃硫酸搖勻，在室溫下反應(yīng)20 min，然后于λmax處以2.0 mL蒸餾水取代標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用液作為空白對(duì)照測(cè)定吸光值。

1.3.4 顯色時(shí)間的選擇

移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品溶液各1.0 mL，置于試管中，依次加入蒸餾水1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，搖勻，在室溫下分別顯色20、40、60、80 min。反應(yīng)終止立即放入冷水中冷卻，在λmax處測(cè)定吸光度，確定反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖測(cè)定的影響。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

分別移取6份供試樣品溶液各0.5 mL，置于具塞試管中，按1.3.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，重復(fù)測(cè)定6次。

1.3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別移取6份供試樣品溶液各0.5 mL，置于具塞試管中，按1.3.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，并計(jì)算多糖含量。

1.3.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

移取5份供試樣品溶液各0.5 mL，分別加入100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按1.3.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.8 密枝瑚菌多糖得率

采用硫酸-苯酚比色法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣液，將密枝瑚菌粗多糖溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，移取0.5 mL粗多糖液，按1.3.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光值，并按如下公式計(jì)算多糖得率。

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖含量(μg);D為提取液總體積(mL);V為測(cè)定液體積(mL);W為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.9 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比為考察因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)［10］，因素水平見表1，并以粗糖提取得率為考察指標(biāo)，篩選最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 密枝瑚菌多糖的定量分析

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液與樣品溶液顯色后，在460～520 nm區(qū)間內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，且最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在490 nm處，故選擇490 nm作為定量測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.3方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖含量c(μg)為縱坐標(biāo)，吸光度(A)為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖關(guān)系曲線，得回歸方程為 y=173.1x+ 1.7061，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。結(jié)果表明，葡萄糖在0～80 μg范圍內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.3 顯色時(shí)間

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和供試樣品溶液顯色后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度呈緩慢下降趨勢(shì)，所以選擇20 min為最佳顯色時(shí)間。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

供試樣品顯色后，在490 nm處平均吸光度為0.286，RSD=2.14%(n=6)，說明硫酸-苯酚法測(cè)定密枝瑚菌多糖含量精密度較高。

2.1.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

供試品溶液中多糖平均含量為1.02%，RSD= 2.07%(n=6)。

2.1.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，說明該法加樣回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，準(zhǔn)確度較高。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Recoveries of polysaccharide in spiked samples

綜上，通過對(duì)線性關(guān)系、顯色穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率的考察，用硫酸-苯酚分光光度法定量分析密枝瑚菌多糖含量簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，該法可用于密枝瑚菌多糖含量的測(cè)定。

2.2 密枝瑚菌多糖提取工藝參數(shù)分析

2.2.1 料液比對(duì)密枝瑚菌多糖得率的影響

選取不同的料液比，分別在90℃下提取1 h，再用濃度95%乙醇沉淀，計(jì)算密枝瑚菌多糖得率，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of ratio of material to water on yield of polysaccharides

由圖1可知，料液比對(duì)多糖的提取效果有一定影響，當(dāng)料液比從1∶10到1∶20時(shí)，多糖得率隨料液比的增加而增加;之后，隨料液比增加，多糖得率開始下降。因此，料液比以1∶20較為合適。

2.2.2 提取溫度對(duì)密枝瑚菌多糖得率的影響

以不同提取溫度為考察因素，選取料液比為1∶20，提取時(shí)間為1 h，計(jì)算密枝瑚菌多糖得率，結(jié)果見圖2所示。

從圖2可以看出，多糖得率隨提取溫度的升高而增加，當(dāng)提取溫度超過90℃ 時(shí)，多糖得率上升幅度趨緩，考慮到多糖為活性物質(zhì)，溫度越高對(duì)其結(jié)構(gòu)和活性影響越大，故提取溫度選取90℃較為合理。

圖2 溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of temperature on yield of polysaccharides

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)密枝瑚菌多糖得率的影響

選取料液比為1∶20，提取溫度為90℃，在此條件，考察提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of time on yield of polysaccharides

由圖3可知，提取時(shí)間對(duì)多糖的提取效果有一定影響。當(dāng)提取時(shí)間小于3 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間超過3 h，隨時(shí)間增加，多糖得率開始下降。因此，選取提取時(shí)間為3 h較合適。

2.2.4 正交試驗(yàn)

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)而優(yōu)化提取工藝參數(shù)，結(jié)果如表3和表4所示。

從表3正交試驗(yàn)結(jié)果和表4方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)多糖得率的影響程度依次為A＞B＞C，優(yōu)化后得最佳提取工藝為A3B3C2，即提取溫度為90℃、提取時(shí)間為3 h、料液比為1∶20。在此條件下多糖得率為2.23%。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal design

表4 提取工藝正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal design results of extraction process

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)線性關(guān)系、顯色穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率的考察，結(jié)果表明，采用硫酸-苯酚分光光度法定量分析密枝瑚菌多糖含量簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，方法準(zhǔn)確，易于操作。

3.2 在以上試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了密枝瑚菌多糖的最佳提取工藝參數(shù)為:料液比1∶20，提取溫度90℃，浸提時(shí)間3 h，在此條件下密枝瑚菌多糖提取率為2.23%。

3.3 本試驗(yàn)首次對(duì)密枝瑚菌多糖的測(cè)定方法和提取工藝參數(shù)進(jìn)行了初步研究。但密枝瑚菌多糖的組成、結(jié)構(gòu)、藥理藥效作用還需要更進(jìn)一步的研究。

1 Mao XL(卯曉嵐).The Chinese Macrofungi(中國(guó)大型真菌).Zhengzhou:Henan Science and Technology Press，2000.403.

2 Zhang XL(張興禮)，Lv HS(呂海生)，Cao DM(曹德明).A preliminary study on the wild edible large fungi in Gansu.J Northwest Normal Univ(西北師范大學(xué)學(xué)報(bào))，1990，3:91-93.

3 Wang BR(王秉仍).The biological activity of polysaccharides and their pharmaceutical value of research.Foreign military medical data(國(guó)外軍事醫(yī)學(xué)資料)，979，1:15.

4 Xiao ZJ(肖智杰)，Wang JJ(王進(jìn)軍)，Lian B(連賓).Actuality of the exploitation and research on production of Ganoderma lucidum.Food Sci(食品科學(xué))，2006，27:837-842.

5 Tan XT(談新提)，Wang YF(王藝峰)，Zhang LN(張俐娜)，et al.Histological observation on effects of anti-tumour of the pachyman polysaccharides modified by chemical technique.Med J Wuhan Univ(武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2004，25:652-654.

6 Zhang JP(張金萍)，Wang JW(王敬文).Preparation of carboxymethyl pachmaran in one step.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2006，18:291-294.

7 Gao H(高虹)，Wang YF(王易芬)，Shi DF(史德芳)，et al.Radio-frequency assisted extraction for polysaccharides from stems of shiitake mushroom.Transactions of the CSAE (農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào))，2009，25:180-184.

8 Zhou L(周林)，Guo SY(郭祀遠(yuǎn))，Cai MY(蔡妙顏)，et al.Study on the properties of moisture absorption and moisture retaining of schizophyllan.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2005，17:708-711.

9Xiao NG(蕭能賡)，Yu RY(余瑞元)，Yuan MX(袁明秀)，et al.Principles and methods of biochemical experiments(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法)，Beijing:Peking University Press，2005.194-196.

10 Ming DX(明道緒).Biometric attached to experimental design(生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)).Beijing:China Agriculture Press，2002.308.

Parameter Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Ramaria stricta

SU Feng-xian，YANG Quan-wen，LI Cai-xia，LI Peng
College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhang ye 734000，China

The extraction technological parameters and measuring method of polysaccharides in Ramaria stricta(Pers.: Fr.)Quél.were investigated.The results showed that the method of phenol-sulfurc acid was simple，accurate，high sensitivity，and good reproducibility for determining the content of polysaccharides in R.stricta.Based on the results of the single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction condition for polysaccharides was obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶20，temperature 90℃，and extraction times 3.0 h.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharides from R.stricta was 2.23%.

Ramaria stricta;polysaccharides;extraction technological parameter

1001-6880(2011)04-0751-04

2009-11-09 接受日期:2010-06-07

*通訊作者 Tel:86-013085925602;E-mail:lipeng@hxu.edu.cn

S567.3+9

A