姜黃素類似物的合成及體外抗氧化活性研究

陳莉敏，康建軍，劉 洋，林友文

福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州350004

姜黃素類似物的合成及體外抗氧化活性研究

陳莉敏，康建軍，劉 洋，林友文*

福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州350004

利用不同的芳香醛和乙酰丙酮縮合反應(yīng)，合成了4種姜黃素類似物(A1～A4)，化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、1H NMR及MS等測(cè)試技術(shù)表征確證。采用鄰苯三酚法研究化合物的體外抗氧化活性，臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法研究體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，化合物A1、A2、A3的抗氧化活性和對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制活性均高于姜黃素，其活性與酚羥基密切相關(guān)。

姜黃素;類似物;合成;抗氧化活性;抗腫瘤活性

姜黃素(Curcumin，1，7-二(4-羥基-5-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮，見Scheme 1)是中藥姜黃的主要成分，是一種天然的酚類食品添加劑。1985年印度Kuttan首次發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗腫瘤活性［1］，近年的研究發(fā)現(xiàn)其還具有廣泛的生物活性如抗氧化、降血脂、抗菌以及抑制HIV-1整合酶活性［2］。姜黃素抗腫瘤作用包括對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡能力，體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和體內(nèi)抑制毛細(xì)血管生成和增長(zhǎng)［3］，而且具有分子量低、毒性小等特點(diǎn)。但由于其在水中溶解度小，穩(wěn)定性差，生物利用度低等限制了應(yīng)用［4］。目前，以新型天然植物活性成分為先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造，是新藥研發(fā)的重要途徑之一，其中姜黃素類似物的研究引起廣泛的重視。

從姜黃素母核結(jié)構(gòu)分析，兩個(gè)取代芳環(huán)通過1，6-庚二烯-3，5-二酮的連接橋鏈B部分把A、C兩個(gè)取代芳環(huán)相連接(見Scheme 1)，并認(rèn)為A、C兩個(gè)不同基團(tuán)取代的芳環(huán)可能為發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元［5］。本文對(duì)芳環(huán)取代基進(jìn)行改造，通過1，7-位芳香環(huán)上取代基位置和種類的變化，在催化劑作用下，利用芳香醛和乙酰丙酮的縮合反應(yīng)合成了一系列姜黃素類似物(見Scheme 2)，研究了它們的體外抗氧化和抗腫瘤活性，并探討A、C兩個(gè)芳環(huán)上取代基對(duì)活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

AVATR 330 FT-IR紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicolet公司)，KBr壓片;1100型高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MSD Trap)(美國(guó)Agilent公司); UNITY 500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國(guó)，Varian公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑;島津2450型紫外可見分光光度計(jì);WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，溫度計(jì)未校正;臺(tái)盼藍(lán)(SIGMA公司);姜黃素、芳香醛及其他試劑均為分析純。

1.2 姜黃素類似物的合成

以四種不同的芳醛為原料，與乙酰丙酮在正丁胺作用下合成四種姜黃素類似物，合成方法如下:在裝有滴液漏斗的三頸瓶中先后加入0.1 mol芳香醛，0.05 mol乙酰丙酮，0.05 mol B2O3粉末，5 mL硼酸三正丁酯，80℃恒溫水浴，充分?jǐn)嚢枞芙猓厰嚢柽叺渭?.5 mL正丁胺，于15 min內(nèi)滴完，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，將體系傾入150 mL熱的HAC中，攪拌2 h后，冰箱靜置冷藏，經(jīng)不同方法分離純化得到目標(biāo)物A1～A4。

A1［1，7-二-(2-羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:冰箱靜置分層，收集下層橙紅色油狀物，濃縮至膠狀透明，用乙醇重結(jié)晶，得到橙紅色晶體，收率85.4%。

A2［1，7-二-(4-羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:冰箱靜置，抽濾水洗析出固體，用乙腈∶水=3∶1重結(jié)晶，得褐色結(jié)晶性粉末，收率78%。

A3［1，7-二-(3，4-二羥基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化同A2，得淺褐色結(jié)晶性粉末，收率84%。

A4［1，7-二-(2-吡啶基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮］的分離純化:反應(yīng)液濃縮，得黑色粘稠物，加少量氯仿溶解后，經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿∶甲醇按4∶1，7∶3和6∶4梯度洗脫，得褐色固體，收率75.2%。

1.3 姜黃素及姜黃素類似物對(duì)O-·2的清除率測(cè)定

在堿性條件下，鄰苯三酚法非常容易發(fā)生自氧化，同時(shí)伴隨著O-·2的生成。本文參照文獻(xiàn)［6］的實(shí)驗(yàn)方法，利用姜黃素類似物對(duì)鄰苯三酚法自氧化的抑制來間接評(píng)價(jià)它們對(duì)O-·2的清除。1.3.1 移取5.00 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，加入4.70 mL去離子水，混勻后在25℃水浴中溫育20 min。取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的0.30 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚，迅速搖勻后倒入比色杯，320 nm下每隔30 s測(cè)定吸光度值α (以5.00 mL Tris-HCl緩沖液和5.00 mL去離子水的混合液為對(duì)照)，以吸光度(α)對(duì)時(shí)間(t)作圖，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率ν0。

1.3.2 平行取5.00 mL pH8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液5份，分別加入4.2，3.7，3.2，2.7，2.2 mL的去離子水，再分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 0.5 mmol/L甲醇溶液的樣品，最后均加入0.3 mL鄰苯三酚使各份總體積保持在10mL，按上述ν0測(cè)定方法測(cè)得姜黃素及黃素類似物在不同濃度下的鄰苯三酚自氧化速率νC，按照公式η=(1－νC/ν0) ×100%計(jì)算求得到各樣品濃度下的清除率η。

1.4 姜黃素類化合物的抗腫瘤活性研究

體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定了姜黃素類似物對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞增殖的抑制作用，篩選模型為臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在96孔培養(yǎng)板上，接種K562細(xì)胞，接種量約5×104個(gè)/孔，每孔200 μL，本次實(shí)驗(yàn)組設(shè)6組，分別加入不同濃度的藥物，使之終濃度分別為:2.5、5、10、20、40、80 ug/mL。對(duì)照組不加藥，每組設(shè)三個(gè)平行孔，37℃培養(yǎng)至48 h，取0.4%臺(tái)盼藍(lán)液與細(xì)胞懸液各50 μL混勻后，再取適量混合液充于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)4個(gè)大格的未染色的活細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組細(xì)胞數(shù)－實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%

以同一藥物的不同濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時(shí)的藥物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 關(guān)于姜黃素類似物的合成反應(yīng)

經(jīng)典的查爾酮衍生物的合成方法是以取代苯乙酮與取代苯甲醛在堿性醇溶液中縮合得到，文獻(xiàn)報(bào)道［7］苯甲醛或苯乙酮上的羥基對(duì)縮合反應(yīng)收率的影響很大，當(dāng)環(huán)上有兩個(gè)或兩個(gè)羥基以上時(shí)，反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行。所以，羥基查爾酮不能用經(jīng)典的方法合成。也有用羥基保護(hù)的方法合成羥基查爾酮，但使用此法結(jié)果先保護(hù)后縮合時(shí)，反應(yīng)還需要脫保護(hù)，操作繁瑣，副產(chǎn)物多，難以分離。

本研究是利用不同的芳香醛和乙酰丙酮在硼酸和硼酸三正丁酯作用下反應(yīng)合成姜黃素類似物，由于乙酰丙酮的3-亞甲基酸性比甲基強(qiáng)，在有機(jī)堿的作用下會(huì)優(yōu)先失去質(zhì)子氫發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物。故在制備中先將乙酰丙酮3-亞甲基與硼酸形成配合物進(jìn)行保護(hù)，避免3-亞甲基優(yōu)先反應(yīng)，然后再與芳香醛進(jìn)行縮合，采用此法副產(chǎn)物少，分離簡(jiǎn)便，收率較高。

2.2 姜黃素類似物的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)的波譜表征

所合成的化合物經(jīng)過了IR、1H NMR和MS等光譜的表征確證，波譜數(shù)據(jù)及產(chǎn)率、理化性質(zhì)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的熔點(diǎn)及IR、1H NMR和MS數(shù)據(jù)Table 1 Melting point，IR，1H NMR and MS data of the target compounds

IR數(shù)據(jù)顯示，A1～A3在3300 cm–1左右均出現(xiàn)羥基吸收峰，而A3由于3位和4位羥基可形成分子內(nèi)氫鍵，所以在3328.08 cm–1處出現(xiàn)一寬而強(qiáng)的峰;結(jié)構(gòu)中的β-二酮由于與之相連的烷基體積較大，且含有芳環(huán)，故ν(C=O)吸收頻率降低，在1600 cm–1～1654 cm–1間出峰。1H NMR數(shù)據(jù)顯示，芳環(huán)上羥基取代數(shù)量及位置的不同，影響芳核上氫的化學(xué)位移，A3由于芳環(huán)上有兩個(gè)羥基取代，所以化學(xué)位移值在A1～A3中處于最低;β-二酮結(jié)構(gòu)中的亞甲基上的H因?yàn)閮蓚€(gè)羰基的吸電子作用，化學(xué)位移值明顯增大。

2.3 姜黃素類似物的體外抗氧化活性

目標(biāo)化合物對(duì)O-·2的清除率的結(jié)果見表2。

表2 目標(biāo)化合物和姜黃素對(duì)O-·2的清除率Table 2 Clearance rate of target compounds and curcumin on superoxide radicals

由表2數(shù)據(jù)可以看出，A1、A2、A3、A4均具有較好的清除O-·2的作用，并且清除作用隨樣品濃度增大呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中A1、A2、A3的體外抗氧化活性高于姜黃素。

2.4 姜黃素類似物對(duì)K562細(xì)胞增殖的體外抑制活性

目標(biāo)化合物對(duì)人的慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞的體外活性初步測(cè)試結(jié)果列于表3。

表3 目標(biāo)化合物和姜黃素對(duì)K562細(xì)胞的體外IC50Table 3 IC50of target compounds and curcumin against K562 cells in vitro

姜黃素的抑制腫瘤活性在一定程度上與其抗氧化活性有關(guān)［8］，一般來說，在姜黃素類化合物中，抗氧化的活性部位有兩個(gè)，一為酚羥基，另一個(gè)是β-二酮的亞甲基。A4結(jié)構(gòu)中用吡啶環(huán)取代苯環(huán)，芳環(huán)無羥基取代，發(fā)現(xiàn)其活性明顯低于姜黃素，與Junko［9］的研究結(jié)果一致。而A1～A3姜黃素類化合物均具有酚羥基和β-二酮結(jié)構(gòu)單元，結(jié)果表明都具有抗氧化和抗腫瘤活性;酚羥基取代在芳環(huán)鄰位使活性高于在其他位置的取代，上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了姜黃素的抑制腫瘤活性在一定程度上與其抗氧化活性有關(guān)的觀點(diǎn)，也表明在姜黃素結(jié)構(gòu)中酚羥基的取代位置是發(fā)揮作用的主要因素。

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9 Junko I，Hironor O，Yoko T，et al.Bioorg Med Chem，2002，10:3481.

Synthesis and in vitro Antioxidant Activity of Curcumin Analogs

CHEN Li-min，KANG Jian-jun，LIU Yang，LIN You-wen*
Faculty of Pharmacy，fujian medical university，fuzhou，350004

Four curcumin analogs(A1-A4)were synthesized with various aromatic aldehyde and 2，4-pentanedione as raw materials via condensation reactions.The structures of all synthesized compounds were characterized by IR，1H NMR and mass spectra.Antioxidant activity in vitro of curcumin analogs were studied by the pyrogallol autoxidation method.Trypan blue staining assay was used to evaluate the in vitro antitumor activity of these derivatives.The results showed that antioxidant activity and the inhibitory activity of K562 cell proliferation of compounds A1，A3and A4was both higher than that of curcumin.The analysis of structure activity shows that the antioxidant and antitumor activities of curcumin analogs are related to-OH groups of Aromatic ring.

curcumin;analogs;synthesis;antioxidant activity;antitumor activity

1001-6880(2011)04-0722-04

2010-02-02 接受日期:2010-05-11

福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目(2009J01158)、福建醫(yī)科大學(xué)教授學(xué)術(shù)發(fā)展基金計(jì)劃(JS09004)、福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA07083)

*通訊作者 E-mail:linhumor@sina.com

R962;R284.3

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