胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3與甲狀腺激素受體α1的相互作用及其對甲狀腺激素應(yīng)答性基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)

裘 佳，馬曉驪，王 欣，陳 虹，黃秉仁

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005

·論著·

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3與甲狀腺激素受體α1的相互作用及其對甲狀腺激素應(yīng)答性基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)

裘 佳，馬曉驪，王 欣，陳 虹，黃秉仁

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005

目的探討胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)與甲狀腺激素受體α1(TRα1)之間的相互作用，及其對甲狀腺激素應(yīng)答性基因轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)節(jié)。方法采用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶拉下實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測IGFBP-3與TRα1之間的相互作用；激光共聚焦顯微鏡觀察兩種蛋白在細(xì)胞中的分布；采用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)IGFBP-3對甲狀腺素T3激活的生長激素啟動(dòng)子的影響。結(jié)果谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶拉下實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明IGFBP-3與TRα1在體內(nèi)和體外都可以相互作用，激光共聚焦顯微鏡觀察IGFBP-3 和 TRα1可以共定位于HEK-293細(xì)胞的細(xì)胞核。通過雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測到過表達(dá)IGFBP-3可以抑制甲狀腺激素對生長激素啟動(dòng)子的激活作用(P<0.01)。結(jié)論IGFBP-3通過與TRα1相互作用抑制甲狀腺激素應(yīng)答性基因的轉(zhuǎn)錄，為IGFBP-3在核內(nèi)發(fā)揮胰島素樣生長因子非依賴的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3；甲狀腺激素受體α1；三碘甲狀腺原氨酸;生長激素啟動(dòng)子

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs)家族在循環(huán)系統(tǒng)中結(jié)合胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)，并被輸送到靶細(xì)胞處發(fā)揮生物活性[1]。IGFPB-3是該家族成員，具有抗增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[2-3]。但是這些作用產(chǎn)生的機(jī)制尚未完全清楚。有研究顯示IGFBP-3不僅可以通過IGFBP-3受體激活半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8) 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]，IGFBP-3還具有核定位序列，可以直接介導(dǎo)IGFBP-3入核，并在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮非IGF-I依賴的作用[5]。有研究顯示IGFBP-3和類維甲酸受體α (retinoid X receptor α，RXRα)共定位于前列腺癌細(xì)胞株LAPC-4的細(xì)胞核。IGFBP-3可以直接和RXRα相互作用， RXRα參與IGFBP-3引起細(xì)胞凋亡[6-7]。另有研究顯示IGFBP-3引起PC-3細(xì)胞凋亡的作用不需要結(jié)合RXRα[8]。IGFBP-3結(jié)合RXRα抑制全反式維甲酸引起的維甲酸應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄激活，并且調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞對全反式維甲酸的反應(yīng)[9]。IGFBP-3還可以與 過氧化物酶體增殖物激活受體γ相互作用，阻止配體引起的過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的激活，并且IGFBP-3抑制該脂肪細(xì)胞分化[10]。

鑒于既往對具有入核性質(zhì)的IGFBP-3與上述核受體信號傳導(dǎo)相關(guān)性的研究，筆者推測IGFBP-3可能還與其他類固醇激素信號傳導(dǎo)有關(guān)，如甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,TR)這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要調(diào)節(jié)蛋白。而受體相關(guān)的共調(diào)節(jié)蛋白，如共激活子和共抑制子的參與能分別增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄。在甲狀腺激素存在情況下，TR構(gòu)象改變，共抑制子被共激活子取代，從而啟動(dòng)了TR調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄激活[11]。本研究擬通過蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)和雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)確認(rèn)IGFBP-3在三碘甲狀腺原氨酸(3, 3’,5-triiodo-L-thyronine，T3)-TR信號傳導(dǎo)中的作用，為深入研究IGFBP-3在核內(nèi)發(fā)揮的非IGF依賴的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

材料pCMV-Myc-TRα1、pEYFP-N1-TRα1和pECFP-N1-IGFBP-3質(zhì)粒已構(gòu)建。pGL3-GH 啟動(dòng)子質(zhì)粒由美國梅奧醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)系/內(nèi)分泌科 Norman Eberhardt 教授惠贈(zèng)。E.coliDH5α和E.coliBL21菌株均為本室保存。人腎上皮細(xì)胞系HEK-293由本室保存。T3購自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自Gibco公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成?？贵w購自Santa Cruz公司、Sigma公司及北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Glutathione SepharoseTM4B和 protein G SepharoseTM4 Fast Flow均購自GE公司。Western blot化學(xué)發(fā)光試劑購自PIERCE公司。Dual-luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司。

細(xì)胞培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基中，在5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

重組載體的構(gòu)建以人肝cDNA文庫為模板，構(gòu)建pGEX-6p-1-TRα1質(zhì)粒，以上游引物5’CGCGGAT- CCATGGAACAGAAGCCAAGCAA3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識別位點(diǎn))及下游引物5’CCCAA- GCTTTTTGGCAAAGTCCACCACA3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶HindⅢ的識別位點(diǎn))擴(kuò)增出TRα1上半段基因片段，以上游引物5’CCCAAGCTTCCCATGTTCTCC- GAGCTGC3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶HindⅡ的識別位點(diǎn))及下游引物5’ACGCGTCGACTTAGACTTCCT- GATCCTCAAAGAC3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶SalⅠ的識別位點(diǎn))擴(kuò)增出TRα1下半段基因片段，先分別克隆入pGEM-T 載體，再各自雙酶切(BamHⅠ、HindⅢ或HindⅢ、SalⅠ)有關(guān)重組質(zhì)粒,將TRα1上、下片段和pGEX-6P-1載體進(jìn)行3片段連接、構(gòu)建出pGEX-6p-1-TRα1。構(gòu)建pCMV-HA-IGFBP-3質(zhì)粒時(shí)，上游引物5’GAAGATCTTGATGCAGCGGGCG3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶BglⅡ的識別位點(diǎn))及下游引物5’ATAGTTTAGCGGCCGCCTACTTGCTCTGCATG- CTGT3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶NotⅠ的識別位點(diǎn))擴(kuò)增出IGFBP-3全長基因片段，經(jīng)BglⅡ、NotⅠ雙酶切后和pCMV-Myc載體連接。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)拉下實(shí)驗(yàn)將GST及其GST融合蛋白表達(dá)菌在異丙基硫代半乳糖苷1 mmol/L及室溫下誘導(dǎo)，菌體加入細(xì)菌裂解液，超聲破菌。取20 μl 75% Glutathione SepharoseTM4B，加入1 ml上述原核表達(dá)蛋白上清，4℃溫育4 h。2000 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗3遍。在表達(dá)另一外源基因如IGFBP-6的真核細(xì)胞裂解液中加入平衡過的Glutathione SepharoseTM4B介質(zhì)，4℃轉(zhuǎn)動(dòng)溫育2 h預(yù)清除。4℃，2000 r/min 離心5 min后將上清與已經(jīng)純化的GST融合蛋白、GST等分別 4℃溫育過夜。離心沉淀物用細(xì)胞裂解緩沖液洗3遍，沉淀做電泳及Western印跡鑒定。

免疫共沉淀與Western印跡將轉(zhuǎn)染pCMV-HA-IGFBP-3或/和pCMV-Myc-TRα1載體后24 h，再加入T3(10-7mol/L) 作用4 h的HEK-293細(xì)胞用放射免疫實(shí)驗(yàn)裂解液裂解，離心后蛋白定量，取100 μg蛋白進(jìn)行預(yù)清除(加入30 μl 蛋白G瓊脂糖凝膠溫育1 h，2 000 r/min離心5 min，取上清)，加入小鼠抗Myc抗體2 μg，4℃溫育過夜，然后加入30 μl蛋白G瓊脂糖凝膠，4℃溫育4 h，2000 r/min離心5 min，用細(xì)胞裂解緩沖液洗沉淀3次，沉淀經(jīng)SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜后作常規(guī)Western印跡鑒定。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET) 將HEK-293細(xì)胞種到含有蓋玻片的6孔板中。約24 h后，實(shí)驗(yàn)組共轉(zhuǎn)染pEYFP-N1-TRα1和pECFP-N1-IGFBP-3質(zhì)粒各2.5 μg，對照組為共轉(zhuǎn)染 pEYFP-N1和pECFP-N1空載體各2.5 μg，轉(zhuǎn)染24 h后,加入T3 10-7mol/L 作用4 h, 棄去培養(yǎng)基，用PBS輕洗兩遍細(xì)胞。加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗細(xì)胞3遍，蓋玻片蓋在滴有防淬滅甘油(10 μl)的載玻片上，指甲油封邊，室溫晾干。激光顯微鏡下觀察細(xì)胞，找到共表達(dá)的細(xì)胞后，采集圖片。敏化發(fā)射光譜法FRET實(shí)驗(yàn)的儀器操作由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)藥分析中心使用Leica confocal laser scanning microscope[12](Leica TCS SP5)完成。

雙螢光素酶報(bào)告基因活性檢測HEK-293細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔轉(zhuǎn)染pGL3-GH-promoter質(zhì)粒0.2 μg及pRL-TK對照質(zhì)粒0.002 μg ，pCMV-Myc-TRα1質(zhì)粒0.5 μg，pCMV-HA-IGFBP-3或其空載體0.5 μg，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h，再加入T3(10-7mol/L)或溶劑作用24 h。棄去培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS洗2次。每孔細(xì)胞加入100 μl 1×被動(dòng)細(xì)胞裂解緩沖液，輕微振蕩，室溫15 min。取10 μl裂解產(chǎn)物加入1.5 ml EP管中，將10 μl螢光素酶檢測試劑Ⅱ加入樣本中，吹吸5次，放入發(fā)光儀中檢測。再在同一個(gè)樣品中加入Stop & Glo?試劑10 μl。TD-20/20發(fā)光測試儀檢測每孔的螢火蟲熒光素酶的測量值F和海腎熒光素酶的測量值R(作為內(nèi)參)，然后計(jì)算F/R。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 11.0軟件分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

GST拉下實(shí)驗(yàn)證明TRα1與IGFBP-3的相互作用及作用結(jié)構(gòu)域

原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-TRα1和真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV-HA-IGFBP-3的構(gòu)建和鑒定：TRα1全長為1233 bp，分兩次擴(kuò)增出全長順序前后兩部分及其克隆(圖1A、B)。3片段連接后獲得的全長TRα1陽性克隆經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ酶切鑒定見圖1C中箭頭所示，測序結(jié)果讀碼框和序列均正確。IGFBP-3全長875 bp，擴(kuò)增片段見圖2A，所獲得的陽性重組克隆經(jīng)BglⅡ和NotⅠ酶切鑒定為陽性，圖2B中箭頭所示為酶切下的IGFBP-3片段，測序結(jié)果讀碼框和序列均正確。

GST拉下實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRα1和IGFBP-3能在體外結(jié)合：圖3A為考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化的GST和GST-TRα1(相對分子質(zhì)量約72 000)。圖3C可見GST-TRα1(條帶7)免疫復(fù)合物泳道中有一條相對分子質(zhì)量為36 000的特異性條帶，其Western結(jié)果與被轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞裂解液直接上樣的HA-IGFBP-3(條帶8)一致，而在GST(條帶6)泳道中，則無任何條帶，該結(jié)果說明只有TRα1與IGFBP-3在體外能進(jìn)行特異性結(jié)合。

GST拉下實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRα1的DNA結(jié)合區(qū)( DNA binding domain，DBD)、配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain,LBD )能與IGFBP-3在體外結(jié)合：圖3B為考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化的GST-TRα1-NTD、GST-TRα1-DBD、GST-TRα1-LBD(條帶3～5)。圖3D中條帶11、12、13即純化的GST-TRα1-DBD、 GST-TRα1-LBD、GST- TRα1泳道中有一條相對分子質(zhì)量為36 000的特異性條帶，其大小與被轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞裂解液中檢測到的HA-IGFBP-3一致，而在GST-TRα1-NTD、GST泳道中，則無任何條帶，該結(jié)果說明TRα1的DBD及LBD可以與IGFBP-3在體外進(jìn)行特異性結(jié)合。

TR：甲狀腺激素受體；M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空白模板對照；2:TRα1編碼順序上半部分?jǐn)U增產(chǎn)物；3:TRα1編碼順序后半部分?jǐn)U增產(chǎn)物；4：重組質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector-TRα1up；5：重組質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector-TRα1up的BamHⅠ及其HindⅢ酶切; 6：重組質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector-TRα1down；7： 重組質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector-TRα1down的HindⅢ及其SalⅠ酶切；8：pGEX-6p-1-TRα1；9：pGEX-6p-1-TRα1的BamHⅠ及其SalⅠ酶切；箭頭示TRα1成熟肽編碼片段TR: thyroid hormone receptor; M: molecular weight marker; 1: control without template; 2: PCR fragment for TRα1up; 3: PCR fragment for TRα1down; 4: recombinant plasmid pGEM-T Easy Vector-TRα1up; 5: pGEM-T Easy Vector-TRα1up digested with BamHⅠ and HindⅢ; 6: recombinant plasmid pGEM-T Easy Vector-TRα1down; 7: recombinant plasmid pGEM-T EasyVector-TRα1down digested with HindⅢ and SalⅠ; 8: recombinant plasmid pGEX-6p-1-TRα1; 9: recombinant plasmid pGEX-6p-1-TRα1 digested with BamHⅠ and SalⅠ; Arrow shows the mature TRα1 peptide-coding sequenceA.TRα1有關(guān)的PCR 片段的擴(kuò)增; B.pGEM-T重組質(zhì)粒及其酶切鑒定;C.pGEX-6p-1-TRα1重組質(zhì)粒及其酶切鑒定A.TRα1 related PCR fragment; B.recombinant plasmids pGEM-T-TRα1 and identification by endonuclease digestion; C.recombinant plasmids pGEX-6p-1-TRα1 and identification by endonuclease digestion

IGFBP-3：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3；M: 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白模板對照； 2：IGFBP-3的擴(kuò)增片段；3：重組質(zhì)粒pCMV-HA-IGFBP-3； 4：重組質(zhì)粒pCMV-HA-IGFBP-3的BglⅡ及NotⅠ酶切；箭頭示成熟肽IGFBP-3編碼序列片段IGFBP-3: insulin-like growth factor binding protein-3；M: molecular weight marker; 1: control without template; 2. IGFBP-3 PCR fragment; 3: recombinant plasmid pCMV-HA-IGFBP-3; 4: recombinant plasmid pCMV-HA-IGFBP-3 digested with BglⅡ and Not Ⅰ；Arrow shows the mature IGFBP-3 peptide-coding sequenceA.IGFBP-3編碼順序的PCR擴(kuò)增；B.重組質(zhì)粒pCMV-HA-IGFBP-3的酶切鑒定A.PCR fragment of IGFBP-3 coding sequence; B.digestion of recombinant plasmid pCMV-HA-IGFBP-3

Mr:相對分子質(zhì)量; GST: 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；M: 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-5：聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離重組蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色(1: GST; 2：重組蛋白GST-TRα1; 3：重組蛋白GST-TRα1-NTD； 4：重組蛋白GST-TRα1-DBD ；5：重組蛋白GST-TRα1-LBD); 6-14：GST-拉下實(shí)驗(yàn) (6：GST; 7：重組蛋白GST-TRα1; 8：IGFBP-3標(biāo)準(zhǔn)品; 9：GST；10：重組蛋白GST-TRα1-NTD；11：重組蛋白GST-TRα1-DBD；12：重組蛋白GST-TRα1-LBD；13：重組蛋白GST-TRα1; 14：IGFBP-3 標(biāo)準(zhǔn)品)；箭頭為有關(guān)蛋白所在位置Mr: relative molecular mass; GST: glutathione-S-transferase; M: molecular weight marker；1-5：recombinant proteins stained by coomassie blue after SDS-PAGE(1: GST； 2: GST-TRα1；3：GST-TRα1-NTD; 4：GST-TRα1-DBD; 5：GST-TRα1-LBD); 6-14：GST pull-down assay (6：GST；7：GST-TRα1； 8：IGFBP-3 standard; 9：GST；10：GST-TRα1-NTD；11：GST-TRα1-DBD； 12：GST-TRα1-LBD；13：GST-TRα1; 14：IGFBP-3 standard)；Arrow showes related GST-fused proteinA. 重組蛋白GST-TRα1的SDS-PAGE后的考馬斯亮藍(lán)染色; B. 含TRα1不同結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色；C. GST拉下實(shí)驗(yàn): GST-TRα1蛋白與IGFBP-3蛋白孵育后電泳分離復(fù)合物并用IGFBP-3抗體進(jìn)行免疫雜交分析；D. GST拉下實(shí)驗(yàn)：IGFBP-3與含有TRα1不同結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白孵育后電泳分離并以IGFBP-3的抗體行免疫印跡雜交A. recombinant proteins GST-TRα1 stained by coomassie blue after SDS-PAGE; B. recombinant GST-fused proteins containing different domains of TRα1 stained by coomassie blue after SDS-PAGE; C. GST pull-down assay：GST-TRα1 incubated with IGFBP-3 , then the complex was separated by SDS-PAGE fellowed by Western blot analysis with antibody against IGFBP-3； D. GST pull-down assay：IGFBP-3 protein was incubated with GST-fused proteins containing different domains of TRα1 and the complex was analyzed by Western immunoblot analysis using antibody against IGFBP-3

免疫共沉淀驗(yàn)證TRα1與IGFBP-3的相互作用pCMV-HA-IGFBP-3和pCMV-Myc-TRα1共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h,再加入T3 10-7mol/L 4h后收獲細(xì)胞。細(xì)胞裂解液加入鼠抗Myc抗體為實(shí)驗(yàn)組，加入鼠IgG孵育作為對照組。以蛋白G捕獲的免疫復(fù)合物，經(jīng)SDS-PAGE電泳后Western blot分析?？笽GFBP-3雜交后，實(shí)驗(yàn)組可以檢測到IGFBP-3的存在，而對照組檢測不到，說明細(xì)胞內(nèi)TRα1與IGFBP-3可以相互作用(圖4)。

FRET實(shí)驗(yàn)確定TRα1與IGFBP-3體內(nèi)的相互作用激光共聚焦顯微鏡觀察顯示與黃色熒光蛋白融合的TRα1和與青色熒光蛋白融合的IGFBP-3在同一激光層切面的同一位置上均表達(dá)，經(jīng)圖像合成后該位置變成綠色，說明TRα1和IGFBP-3可以共同存在于細(xì)胞的細(xì)胞核(圖5A)。

采用敏化發(fā)射光譜法的方法，計(jì)算能量轉(zhuǎn)移效率。同樣方法計(jì)算對照組的轉(zhuǎn)移效率。兩組轉(zhuǎn)移效率的平均值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示增強(qiáng)型青色熒光蛋白-IGFBP-3和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白-TR 在T3存在時(shí)與增強(qiáng)型青色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃色熒光蛋白比較，存在明顯的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(P<0.01)，說明這兩種蛋白之間存在直接相互作用。在無T3時(shí)，與增強(qiáng)型青色熒光蛋白/增強(qiáng)型黃色熒光蛋白共轉(zhuǎn)染比較，存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的弱的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(P<0.05)，說明也有較弱的相互作用(圖5B)。

IGFBP-3負(fù)性調(diào)節(jié)T3結(jié)合的TR對基因的激活作用構(gòu)建的報(bào)告基因含生長激素基因的-500 bp的啟動(dòng)子，其中有甲狀腺激素應(yīng)答元件。在未轉(zhuǎn)染TR的HEK-293細(xì)胞中甲狀腺素未能刺激報(bào)告基因的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染了TR后甲狀腺素明顯刺激報(bào)告基因的表達(dá)，共轉(zhuǎn)染TR及用于IGFBP-3表達(dá)的空載體后結(jié)果類似，即也刺激報(bào)告基因的表達(dá)。但在檢測共轉(zhuǎn)染TR及IGFBP-3時(shí)發(fā)現(xiàn)在無T3作用下對生長激素啟動(dòng)子的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在過表達(dá)IGFBP-3的細(xì)胞中，T3引起生長激素啟動(dòng)子活性增強(qiáng)的作用明顯減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6)。

討 論

核受體是一類需要許多蛋白-蛋白相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。甲狀腺激素的作用依賴于TR和共調(diào)節(jié)子。 甲狀腺激素受體與RAR、RXR和維生素D受體等同屬非類固醇激素核受體超家族。和核受體家族的其他成員一樣，TR包括N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、DBD、鏈接區(qū)，還有含有AF-2激活區(qū)的C端LBD，在配體甲狀腺激素結(jié)合后TR構(gòu)象改變。TR以同源二聚體或與RXR以異二聚體形式結(jié)合甲狀腺激素應(yīng)答元件，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究通過GST-拉下實(shí)驗(yàn)證實(shí)TR的DBD與LBD均參與了與IGFBP-3的相互作用(圖3)。另有研究顯示當(dāng)RXR的不同區(qū)域被獨(dú)立表達(dá)時(shí)，只有DBD結(jié)合IGFBP-3[13]。本研究與其結(jié)果相似但存在不同。

IP：免疫沉淀； IB：免疫印跡雜交IP: immunoprecipitation; IB: immunoblot

在T3存在下，與TR及用于IGFBP-3表達(dá)的空載體共轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.01aP<0.01 compared with the co-transfection with TR or TR + vector group in the presence of T3

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)說明IGFBP-3與TRα1之間在蛋白過表達(dá)的情況下有相互作用(圖4)。但是尚需要內(nèi)源性的蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)才能更為準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用情況。

為了更接近IGFBP-3與核受體生理狀態(tài)，探尋其在完整的細(xì)胞內(nèi)相互作用的可能性，筆者進(jìn)行了免疫熒光和FRET實(shí)驗(yàn)(圖5)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IGFBP-3可以與TRα1共定位于HEK-293 細(xì)胞的細(xì)胞核，為相互作用實(shí)驗(yàn)提供了較為直觀的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10 nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象。本研究構(gòu)建了pECFPG-N1-IGFBP-3和pEYFP-N1-TR真核表達(dá)載體，敏化發(fā)射光譜法證實(shí)熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的存在，是在T3作用下IGFBP-3與TR相互作用的再次證明。

GH啟動(dòng)子含有甲狀腺素應(yīng)答元件，加入T3后明顯激活啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，過表達(dá)的IGFBP-3則抑制這種激活，提示IGFBP-3抑制了T3反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄(圖6)。綜上，本研究提示IGFBP-3通過與TR相互作用影響了T3-TR介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄?；谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為存在著一條新的影響T3-TR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑,這為IGFBP-3在核內(nèi)發(fā)揮非IGF依賴的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(本文圖5見插圖第4頁)

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Insulin-likeGrowthFactorBindingProtein-3InteractswiththeThyroidHormoneReceptorα1andModulatesTranscriptionofThyroidHormoneResponsiveGene

QIU Jia, MA Xiao-li, WANG Xin, CHEN Hong, HUANG Bing-ren

National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005, China

HUANG Bing-ren Tel:010-65228797，E-mail: huangbr@public.bta.net.cn；

ObjectiveTo study the interaction between insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) and thyroid hormone receptor α1 (TRα1) and the modulatory effect of IGFBP-3 on transcription of the thyroid hormone responsive gene.MethodsThe interaction between IGFBP-3 and TRα1 was detected with glutathione-S-transferase pull-down method, co-immunoprecipitation, fluorescence resonance energy transfer test. The cellular distribution of these two proteins was observed by confocal laser scanning microscopy. The effect of IGFBP-3 on the growth hormone promoter activity stimulated by triiodothyronine (T3) was determined by dual-luciferase reporter assay.ResultsIGFBP-3 interacted with TRα1 bothinvivoandinvitro. IGFBP-3 and TRα1 were shown to co-localize in the nucleus of HEK-293 cells. The overexpressed IGFBP-3 inhibited the growth hormone promoter activity stimulated by T3 (P<0.01).ConclusionsIGFBP-3 interacts with TRα1 and inhibits T3 responsive gene transcription. This finding further confirms the insulin-like growth factor-independent role of IGFBP-3 in the nucleus.

insulin-like growth factor binding protein-3; thyroid hormone receptor α1; triiodothyronine; growth hormone promoter

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：156-161

黃秉仁 電話:010-65228797，電子郵件: huangbr@public.bta.net.cn；
陳 虹 電話:010-65296980，電子郵件: hchen@public.bta.net.cn

Q571

A

1000-503X(2011)02-0156-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.012

CHEN Hong Tel:010-65296980，E-mail: hchen@public.bta.net.cn

2010-07-23)