胰腺干細胞誘導分化后同種移植治療糖尿病的實驗研究

史光軍 張磊 許評 欒紹海 于江 陳昊強

·論著·

胰腺干細胞誘導分化后同種移植治療糖尿病的實驗研究

史光軍 張磊 許評 欒紹海 于江 陳昊強

目的探討胰腺干細胞體外定向分化潛能，評價誘導分化后細胞同種移植對糖尿病的治療效果。方法體外分離、純化成體Wistar大鼠胰腺干細胞，運用熒光免疫染色法對胰腺干細胞表面進行鑒定，然后在肝細胞生長因子、尼克酰胺等共刺激下誘導細胞定向分化。雙硫腙(DTZ)染色對誘導后細胞進行胰島細胞鑒定，ELISA染色光電酶標記法檢測其胰島素分泌功能。采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立Wistar大鼠糖尿病模型，將40只造模成功的大鼠隨機分為胰島細胞移植組(移植組)和安慰劑注射組(對照組)，分別于移植前1 d及移植后1、2、3、4周經(jīng)尾靜脈采血檢測血清胰島素和血糖水平。結(jié)果本實驗成功獲取成體大鼠胰腺干細胞，細胞表面CK19、 Pdx-1和Nestin表達均為陽性。誘導分化后的細胞DTZ染色呈棕紅色，在高糖刺激下表達、分泌胰島素。移植后4周內(nèi)移植組血清胰島素水平平均為(11.41±1.52)mU/L，血糖水平平均為(8.22±2.7)mmol/L，對照組分別為(9.30±1.56)mU/L和(12.23±3.8) mmol/L，兩組相差顯著(P<0.05)。結(jié)論體外分離成體胰腺干細胞可被定向誘導分化為具有胰島素分泌功能的胰島樣細胞，同種移植后對糖尿病具有治療作用。

胰腺； 干細胞； 細胞分化； 同種移植； 糖尿病

糖尿病是危害人類健康的疾病之一，發(fā)病率逐年上升。臨床以糖、脂代謝異常，內(nèi)分泌功能紊亂為主要特點。長期的高血糖刺激可導致多種嚴重并發(fā)癥的出現(xiàn)，危及生命。目前對1型糖尿病主要采用胰島素替代治療，花費昂貴，患者痛苦。胰島移植為糖尿病患者擺脫外源胰島素依賴帶來了一線曙光，但臨床胰島細胞來源的匱乏限制了其臨床應用。干細胞具有自我更新和不斷增殖的能力，且具有多向分化潛能[1]，并已有將胰腺干細胞誘導為胰島細胞治療糖尿病的報道。本文應用胰腺干細胞定向誘導的胰島細胞治療糖尿病大鼠，為臨床應用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、胰腺干細胞的分離、擴增及鑒定

Wistar大鼠，4～6周齡，體重160～230 g，雌性，購于山東魯抗醫(yī)藥動物飼養(yǎng)中心。適應性喂養(yǎng)1周以上。麻醉后無菌進腹，暴露膽總管，鉗夾膽總管兩端，用10號套管針行膽胰管穿刺，注入1 mg/ml的Ⅴ型膠原酶5 ml后完整切除胰腺，置于4℃ Hank′s液。移入超凈工作臺，棄Hank′s液，加入約為胰腺組織體積3倍的Ⅴ型膠原酶，38℃水浴消化10 min，每3 min震蕩1次，至胰腺組織消化成細沙粒狀時加入含10% FCS的冷Hank′s液，過濾網(wǎng)，離心棄上清，Hank′s液洗滌2遍后制成細胞懸液，應用Ficoll 400濃度梯度(23%、17%、11%)2000 r/min離心10 min，吸出干細胞層，常規(guī)培養(yǎng)[2]。7 d后改用含10% FCS、100 U/ml青霉素-鏈霉素、20 ng/ml EGF、bFGF、10 mmol/L HEPES，1.0 mmol/L丙酮酸鈉、71.5 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液1次。貼壁干細胞用0.25%胰酶、EDTA消化，按1∶2傳代，以后按1∶3～1∶4傳代培養(yǎng)[3]。取傳代細胞行爬片培養(yǎng)，按文獻[4]的方法，應用SABC-FITC免疫熒光染色檢測細胞角蛋白(CK19)、胰十二指腸同源框因子-1(Pdx-1)、神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、胰島素及胰高糖素的表達，以PBS替代一抗作為對照，通過熒光顯微鏡觀察并攝片。

二、胰腺干細胞的誘導分化及胰島素釋放測定

取傳代細胞在含有2 g/L牛血清白蛋白(BSA)、10 mmol/L尼克酰胺、10 μg/L肝細胞生長因子(HGF)、71.5 ng/ml胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)和100 U/L青霉素-鏈霉素的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中進行誘導分化,每2～3 d換液一次。培養(yǎng)1周后行雙硫腙(DTZ)染色鑒定[5]。將誘導分化后的細胞更換為高糖(10 mmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，每隔30 min吸取培養(yǎng)液1次，共8次。應用ELISA染色光電酶標記法測定培養(yǎng)液的胰島素含量，制作胰島素釋放曲線圖。

三、大鼠糖尿病模型的制作及分組

Wistar大鼠造模前禁食6 h。應用枸櫞酸緩沖液(pH 4.0～4.5)將鏈脲佐菌素(STZ)配制成5 mg/ml溶液[6]，10 min內(nèi)按65 mg/kg體重的標準向大鼠的腹腔內(nèi)一次性注射，注射后72 h內(nèi)補充葡萄糖。注射STZ 48 h后尾靜脈采血2次，測血糖>16.7 mmol/L,即為造模成功，成模率達93%。

按數(shù)字表法將40只成模的糖尿病大鼠隨機分為胰島樣細胞移植組(移植組)和對照組，各20只。移植組經(jīng)尾靜脈注入500目胰島樣細胞當量(約2600個)[7]。對照組注入等容積生理鹽水。移植前1 d及移植后1、2、3、4周檢測血清胰島素和血糖值。

四、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、胰腺干細胞的形態(tài)變化及鑒定

吸出的干細胞層培養(yǎng)2 d后細胞增多，添加細胞因子后生長加速，細胞成梭形(圖1)，7 d后細胞融合80%以上，可穩(wěn)定傳至8代。傳代細胞表面CK19、 Pdx-1和Nestin表達均為陽性(圖2)，而胰島素及胰高糖素表達均為陰性。

圖1早期貼壁的胰腺導管干細胞(×200)圖2細胞表面CK19(a)、Pdx-1(b)和Nestin(c)陽性表達(免疫熒光 ×200)

二、胰腺干細胞的分化及胰島素分泌量

胰腺干細胞經(jīng)尼克酰胺和HGF誘導后分化為胰島樣細胞團，用DTZ染成棕紅色(圖3)。在高糖刺激下，培養(yǎng)液中胰島素含量隨著時間的延長而不斷增高(圖4)。

圖3 誘導分化后的細胞(DTZ染色 ×400)

圖4 胰島素釋放曲線

三、胰島樣細胞移植對糖尿病大鼠血清胰島素和血糖的影響

移植組大鼠胰島素分泌量較移植前明顯增加，以移植后第1、2、3周增加最多，血糖相應明顯下降(表1)。

討 論

糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者主要采用

胰島素替代治療，但不能阻止糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥發(fā)生，且需終生治療。胰島移植是治療糖尿病的一種有效手段，但由于胰島細胞供體來源不足，限制了胰島移植的臨床應用。胰腺干細胞體外分離培養(yǎng)、誘導分化的成功為臨床開展胰島移植提供新的思路。

胰腺干細胞的鑒定主要依據(jù)細胞表面的標志物。常用于鑒定的表面標志物有CK19[8]、Nestin[9]、Pdx-1[10]、胰島素增強子1等。此外還有學者應用Notch信號、kit基因、端粒酶活性等鑒定胰腺干細胞，但尚無定論。

尼克酰胺(Nicotinamide)是一種核酶多聚合成酶抑制劑,因其能誘導人類胚胎胰島內(nèi)分泌細胞的分化和成熟,增加胰島素和C肽的表達而廣泛用于干細胞向胰島內(nèi)分泌細胞分化的研究中。本實驗采用尼克酰胺和含ITS的培養(yǎng)基對其進行誘導分化，結(jié)果顯示誘導后干細胞的胰島素含量明顯升高，表明胰腺干細胞誘導后向胰島樣細胞分化。

根據(jù)正常胰島細胞可被DTZ特異性染成棕紅色這一特性可鑒定誘導后的胰島樣細胞。本實驗誘導后的細胞被染成棕紅色證實為胰島樣細胞。

對STZ誘導的糖尿病大鼠模型進行胰島細胞移植的途徑有腹腔注射、門脈血管、腎被膜下、穴位注射等[11]。移植部位選擇的關(guān)鍵是要使移植入體內(nèi)的胰島細胞有更好的營養(yǎng)供應，利于成活，保持更長的胰島素分泌功能，并盡可能地避免免疫排斥的影響。我們選擇腹腔注射法，其優(yōu)點為：(1)操作簡便，選擇大鼠左下腹一次性注射，效率高；(2)對組織的損失小，不易損傷內(nèi)臟器官，降低感染風險，降低死亡率；(3)可在腹腔內(nèi)完成種植，獲得腹腔內(nèi)液體的營養(yǎng)，延長功能持續(xù)時間。

目前通過不斷改進誘導培養(yǎng)條件使分化細胞功能更趨于完善，胰島素分泌量不斷提高，甚至于接近正常原生細胞的分泌量，在STZ誘導的糖尿病動物模型中可以逆轉(zhuǎn)其高血糖[12]，達到免于胰島素治療的目的。但同樣存在許多問題：(1)STZ誘導的糖尿病只是選擇性破壞了胰腺β細胞，并不能完全模擬1型糖尿病的病理過程；(2)主要針對自身胰腺β細胞的免疫識別是否會同樣攻擊即便是同種基因分化而來的胰島細胞，是否還需要使用免疫抑制劑治療；(3)干細胞具有無限的分化潛能，同時也保留了腫瘤細胞的特性，是否有潛在的形成腫瘤的危險；(4)胰腺干細胞誘導分化后的體內(nèi)移植實驗尚缺乏長期的療效評估。這些都是我們今后應該努力研究的方向。

表1 胰島樣細胞移植前后血清胰島素及血糖的變化

注：與對照組比較，aP<0.05；bP<0.01

[1] Bonner-Weir S.Stem cells diabetes:What has been achieved.Horm Res,2003,60:10-12.

[2] 陳海燕,張強,吳英，等.成年大鼠胰腺導管干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定.南京醫(yī)科大學學報(自然科學版)，2008,17:273-277.

[3] Morini S,Braun M,Onori P,et al.Morphological changes of isolated rat pancreatic islets: a structural, ultrastructural and morphometric study.J Anat, 2006, 209:381-392.

[4] Bouwens L.Islet morphogenesis and stem cell markers.Cell Biochem Biophys,2004,40:81-88.

[5] Rovira M,Scott SG,Liss AS,et al.Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107:75-80.

[6] de la Garza-Rodea AS,Kna?n-Shanzer S,den Hartigh JD,et al.Anomer-equilibrated streptozotocin solution for the induction of experimental diabetes in mice (Mus musculus).J Am Assoc Lab Anim Sci,2010,49:40-44.

[7] Hori Y.Insulin-producing cells derived from stem/progenitor cells: therapeutic implications for diabetes mellitus.Hori Y.Med Mol Morphol,2009,42:195-200.

[8] Boaan-Sobkowska J,Zabel M,Wozniak W,et al.Polyhormonal aspect of the endocrine cells of the human fetal pancreas.Histochem Cell Biol,1999,112:147-153.

[9] Hunziker E,Stein M.Nestin-expressing cells in the pancreatic istets of Langerhans.Biochem Biophys Res Conmun,2000,271:116-119.

[10] Gaghardino JJ,Del Zotto H,Massay L,et al.Pancreatic duodenal homebox-1 and islet neogenseis-associated protein:possible combined marker of activa-teable perxreatic cell precursors.J Endocrinol,2003,177:249-259.

[11] 劉克昌,魏立華，曹宗獻，等.間斷小量多次微囊化胰腺腹腔移植的實驗研究.世界華人消化雜志,2000,8:228-230.

[12] Huang Y,Kucia M,Hussain LR,et,al.Bone marrow transplantation temporarily improves pancreatic function in streptozotocin-induced diabetes: potential involvement of very small embryonic-like cells.Transplantation,2010,89:677-685.

2010-11-19)

(本文編輯：屠振興)

Pancreaticstemcellsdifferentiationandallograftforthetreatmentofdiabetes

SHIGuang-jun,ZHANGLei,XUPing,LUANShao-Hai,YUJiang,CHENHao-qiang.

DepartmentofPancreatic-BiliarySurgery,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266071,China

XUPing,Email:xu.ping@263.net

ObjectiveTo investigate the potential of pancreatic stem cells (PSCs) directed differentiation in vitro, and to evaluate the effects of differentiated PSCs allograft on the treatment of diabetes.MethodsThe PSCs of adult Wistar rats were separated and purified in vitro. The surface of PSCs was determined by immunofluorescence staining, and then it was stimulated by hepatocyte growth factor (HGF) and nicotinamide to induce directed differentiation. Dithizone dyeing was used to determine the islet-like cells after induction, and ELISA staining method was used to detect the insulin levels. Streptozotocin peritoneal injection was used to induce the diabetic rat mode. 40 rats were randomly allocated into pancreatic islet cells allograft group (experiment group) and placebo group.The serum insulin and glucose levels 1 d before transplantation and 1, 2, 3, 4 week after transplantation were measured.ResultsPSCs of adult Wistar rats were successfully obtained, and the expression of CK19, Pdx-1 and Nestin on cell surface was positive. Dithizone dyeing for directed differentiation cells showed brownish red color. The cells could express and secrete insulin after hyperglycaemia stimulation. The serum insulin and glucose levels 4 week after transplantation were(11.41±1.52)mU/L and(8.22±2.7)mmol/L, which were (9.30±1.56)mU/L and(12.23±3.8)mmol/L in the placebo group, and difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPSCs can be induced and directed differentiated in vitro into islet-like clusters with insulin secretion function. And its allograft has the potential for the treatment of diabetes.

Pancreatic; Stem cells； Cell differentiation; Homograft; Transplantation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.017

青島市科技局基金項目計劃(07-2-1-2-nsh)

266071 山東青島，青島市立醫(yī)院肝膽胰外科(史光軍、許評、欒紹海、于江、陳昊強)；濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診外科(張磊)

許評，Email:Xu.ping@263.net