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    同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在急性壞死性胰腺炎大鼠中的遷移和分化

    2011-11-22 00:47:02陸奕高軍吳洪玉龔燕芳趙航李兆申
    中華胰腺病雜志 2011年1期
    關(guān)鍵詞:原位雜交壞死性陽性細(xì)胞

    陸奕 高軍 吳洪玉 龔燕芳 趙航 李兆申

    ·論著·

    同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在急性壞死性胰腺炎大鼠中的遷移和分化

    陸奕 高軍 吳洪玉 龔燕芳 趙航 李兆申

    目的觀察同種異體來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠中的遷移及分化狀況。方法分離、純化雄性SD大鼠的骨髓MSCs。按數(shù)字表法將雌性SD大鼠分為正常移植組、ANP移植組和ANP組,每組10只。采用腹腔注射L-精氨酸方法制備ANP模型。24 h后2個(gè)移植組大鼠經(jīng)尾靜脈輸注MSCs。移植后72 h處死大鼠,取胰腺及心臟、肝臟、腎臟組織標(biāo)本。胰腺組織常規(guī)病理檢查并評(píng)分,采用原位雜交方法檢測(cè)各組織Y染色體雄性鑒別基因sry片段的存在。結(jié)果分離的MSCs在培養(yǎng)3~5 d內(nèi)快速分裂增殖,形成集落,傳代培養(yǎng)至第3代,CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群達(dá)到95%以上。ANP組大鼠胰腺組織大片壞死,大量炎細(xì)胞浸潤,病理分值為(10.31±0.85)分,顯著高于ANP移植組的(7.30±0.79)分(P﹤0.05)。移植組大鼠的心臟、肝臟、胰腺、腎臟均可檢測(cè)到sry基因。正常移植組胰腺組織可見散在分布的sry陽性細(xì)胞;ANP移植組胰腺組織可見較多sry陽性細(xì)胞,且多聚集于損傷較嚴(yán)重的部位。結(jié)論炎性損傷的胰腺組織可能具有招募MSCs的能力,并能減輕大鼠胰腺局部的炎癥反應(yīng)。

    胰腺炎,急性壞死性; 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞; 細(xì)胞運(yùn)動(dòng); 細(xì)胞分化; 原位雜交

    干細(xì)胞移植已經(jīng)初步應(yīng)用于多種人類疾病的治療[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具備很強(qiáng)的分化潛能,在特定條件下,可誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞[2-3],還可隨血液循環(huán)到達(dá)其他器官組織[3], 以滿足其生理更新和病理損傷修復(fù)的需要。文獻(xiàn)報(bào)道[3-4],動(dòng)員MSCs可減輕重癥急性胰腺炎病情,改善其預(yù)后。本研究觀察同種異體MSCs在正常大鼠與急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織中的遷移、分化情況。

    材料與方法

    一、MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

    100~150 g雄性SD大鼠,由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。在無菌條件下分離出股骨。剪開骨端,用10%FBS反復(fù)沖洗髓腔,直至骨干發(fā)白。骨髓沖洗液以800 r/min離心5 min,棄上清,加入含10%FBS的DMEM+F12(Gibco BRL公司)培養(yǎng)液5 ml吹打均勻,按5×105/cm2密度接種于含上述培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)90%融合時(shí)傳代,此后約1周左右傳代一次。傳至第三代時(shí)收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù),分別加入5個(gè)離心管,每管約105個(gè)細(xì)胞。3個(gè)管分別加入anti-CD29-PE/CY5(Biolegend公司)、anti-CD44-FITC(AbD Serotec公司)、anti-CD45-PE(Biolegend公司);1個(gè)管同時(shí)加入3種抗體(混合管);1管為空白管。常溫下避光孵育30 min后PBS洗滌二次,重懸細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)分析CD29+CD44+CD45-細(xì)胞占總體細(xì)胞比例。

    二、大鼠模型的建立及MSCs移植

    雌性SD大鼠,亦由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。體重180~220 g,清潔級(jí),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常移植組、ANP移植組和ANP組,每組10只。參考文獻(xiàn)[5],以腹腔注射L-精氨酸(Sigma公司)2.5 g/kg體重2次、間隔1 h方法制備急性壞死性胰腺炎(ANP)模型。造模后24 h,2個(gè)移植組大鼠經(jīng)尾靜脈輸注三代以上的MSCs(5~7)×107個(gè)。72 h后處死,取胰腺及心臟、肝臟、腎組織,常規(guī)固定。

    三、病理檢查及原位雜交

    胰腺組織常規(guī)病理檢查,采用盲法由病理科醫(yī)師閱片,按照Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行評(píng)分。對(duì)胰腺及心、肝、腎組織,應(yīng)用大鼠雄性決定基因Y染色體的sry探針(天津?yàn)笊锕?行原位雜交。

    結(jié) 果

    一、MSCs體外培養(yǎng)特征

    原代培養(yǎng)時(shí), MSCs大量增殖形成“爆發(fā)”樣集落,同時(shí)也存在散在分布的貼壁MSCs,呈現(xiàn)為三角形、梭形等形態(tài),小部分細(xì)胞可呈單極、多角或不規(guī)則形狀。傳代培養(yǎng)后,散在分布的貼壁MSCs依然呈梭形、三角形、多角形等形態(tài)。起初,數(shù)個(gè)增殖活躍的MSCs稀疏排列在一起,3~5 d內(nèi),細(xì)胞大量分裂增殖,快速形成集落 (圖1)。

    圖1 原代(a)及傳代(b)培養(yǎng)的MSCs(×100)

    二、MSCs細(xì)胞表型

    原代培養(yǎng)細(xì)胞有多個(gè)細(xì)胞群,主要有CD29+CD44+CD45-, CD29+CD44-CD45+, CD29+CD44-CD45-等,其中CD29+CD44+CD45-群為MSCs細(xì)胞。傳代培養(yǎng)后CD29+CD44+CD45-群的比例增加,至第3代時(shí),達(dá)到95%以上。

    三、大鼠胰腺組織病理改變

    ANP組大鼠胰腺明顯充血、水腫;鏡下見胰腺組織腺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞,大片壞死,大量炎細(xì)胞浸潤,病理分值為(10.31±0.85)分。ANP移植組胰腺充血水腫較ANP組明顯改善;鏡下見腺泡結(jié)構(gòu)較完整,少量炎細(xì)胞浸潤,出血及壞死均較ANP組明顯減輕,病理分值為(7.30±0.79)分,較ANP組顯著降低(P﹤0.05)。正常移植組胰腺大體及鏡下均無明顯改變(圖2左)。

    四、同種異體移植MSCs在體內(nèi)的定位

    正常移植組和ANP移植組大鼠的心臟、肝臟、胰腺、腎臟均可檢測(cè)到sry基因,而ANP組大鼠未檢測(cè)到sry基因。正常移植組胰腺內(nèi)見散在的sry陽性細(xì)胞;ANP移植組大鼠胰腺內(nèi)也可見sry陽性細(xì)胞,多聚集于損傷較嚴(yán)重部位的細(xì)胞內(nèi);ANP組大鼠胰腺內(nèi)未見sry陽性細(xì)胞(圖2右)。

    圖2正常移植組(a)、ANP移植組(b)和ANP組(c)胰腺組織病理改變(左列,HE ×200)和胰腺組織sry陽性細(xì)胞(右列,原位雜交 ×200)

    討 論

    生理情況下,胰腺的自我更新依賴于胰腺干細(xì)胞。Bonner-Weir等[7]切除大鼠90%胰腺后,殘存的胰腺明顯增殖,形成新的胰島和胰腺外分泌組織,提示胰腺存在能分化成具有特異功能的細(xì)胞。Ishiwata等[8]在L-精氨酸誘導(dǎo)胰腺炎的胰腺組織內(nèi)檢測(cè)到nestin陽性細(xì)胞,提示胰腺成體干細(xì)胞參與了胰腺的再生。

    分離、純化人胰腺成體干細(xì)胞比較困難,而MSCs則有取材方便、創(chuàng)傷性小、不受倫理道德和移植免疫排斥影響等優(yōu)點(diǎn),并可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外分離培養(yǎng)的大鼠MSCs可遷移至胰腺組織。在ANP大鼠,干細(xì)胞多聚集于損傷較嚴(yán)重的部位,推測(cè)損傷部位可能產(chǎn)生某種細(xì)胞因子,招募干細(xì)胞到達(dá)該部位參與組織損傷修復(fù),與Prockop[9]的研究結(jié)果一致。移植MSCs后,ANP大鼠胰腺的炎癥損傷程度明顯低于對(duì)照組,表明同種異體移植的MSCs在胰腺新的微環(huán)境下轉(zhuǎn)化為胰腺干細(xì)胞,參與胰腺組織重建,遏制胰腺進(jìn)行性壞死。當(dāng)然,MSCs在胰腺發(fā)生轉(zhuǎn)分化的直接證據(jù)需要通過原位雜交與免疫組化共定位來進(jìn)一步證實(shí)。

    [1] Bianel P,Robey PG.Stem cells in tissue engineering.Nature,2001,414:118-121.

    [2] Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics.Circ Res,2004,95:9-20.

    [3] Cui HF,Bai ZL.Protective effects of transplanted and mobilized bone marrow stem cells on mice with severe acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2003,9:2274-2277.

    [4] 江學(xué)良,李兆申,崔慧斐.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用.世界華人消化雜志,2006,14:398-404.

    [5] Tani S,Itoh H,Okabayashi Y,et al.New model of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of arginine in rats.Dig Dis Sci,1990,35:367-374.

    [6] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

    [7] Bonner-Weir S,Taneja M,Weir GC,et al.In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:7999-8004.

    [8] Ishiwata T,Kudo M,Onda M,et al.Defined localization of nestin expressing cells in L-arginine induced acute pancreatitis.Pancreas,2006,32:360-368.

    [9] Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.Science,1997,276:71-74.

    2010-02-05)

    (本文編輯:屠振興)

    Migrationanddifferentiationofintravenouslytransplantedbonemarrowmesenchymalstemcellsinratswithacutenecrotizingpancreatitis

    LUYi,GAOJun,WUHong-yu,GONGYan-fang,ZHAOHang,LIZhao-shen.

    DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

    LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

    ObjectiveTo observe whether the intravenously transplanted homologous bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) can migrate to the impaired pancreas tissue in the rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsMSCs were isolated from bone marrow of male Sprague-Dawley (SD) rats and adhered to the culture plate in vitro. Female rats were divided randomly into 3 groups: normal transplantation group, ANP transplantation group, ANP group with 10 rats in each group. ANP was induced by intraperitoneal injections with L-arginine. Both transplantation group

    MSCs infusion through tail vein. 72 h later, the rats were sacrificed, the pancreas, heart, liver and kidney tissues were harvested, and the morphological changes were examined and scored, the characteristics of migration of MSCs to pancreas were detected with the expression of sry gene of Y chromosome by using chromogenic in situ hybridization (CISH).ResultsRapid proliferation occurred in isolated MSCs after culture for 3~5 days and colonies were formed. After 3 generations, CD29+CD44+CD45-cells accounted for over 95% of all the cells. There ware massive tissue necrosis, inflammatory cells infiltration in the pancreas of ANP group, the pathological score was 10.31±0.85, which were significantly higher than that in ANP transplantation group (7.30±0.79,P﹤0.05). Sry gene could be detected in the pancreas, heart, liver and kidney tissues. In addition, scattered distributed sry positive cells were observed in the normally transplanted pancreatic tissue, lots of sry positive cells were observed in the ANP transplanted pancreatic tissue, and they were located in the most injured areas.ConclusionsThe inflammatory pancreatic tissue has the ability of recruiting MSCs in vivo, which can alleviate local inflammation.

    Pancreatitis, acute necrotizing; Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell movement; Cell differentiation; In situ hybridization

    10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.014

    國家自然科學(xué)基金(30670943)

    200433 上海,第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科(陸奕、高軍、吳洪玉、龔燕芳、李兆申);上海市第六人民醫(yī)院內(nèi)科(陸奕);上海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(趙航)

    李兆申,Email:zhsli@81890.net

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