Artemin及其受體GFRα3在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及意義

孟令新 丁兆軍 陳希平 費(fèi)立升 張紅 王曉芳

·論著·

Artemin及其受體GFRα3在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及意義

孟令新 丁兆軍 陳希平 費(fèi)立升 張紅 王曉芳

目的探討Artemin及其受體GFRα3(glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α3)在胰腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化、PCR、熒光定量RT-PCR和基因測(cè)序等方法檢測(cè)100例人胰腺導(dǎo)管癌組織標(biāo)本和40例正常胰腺組織的Artemin、GFRα3表達(dá)，分析它們與臨床病理學(xué)特征，尤其與嗜神經(jīng)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果100例標(biāo)本中64例存在神經(jīng)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為64%。Artemin、GFRα3蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)量分別為正常胰腺組織的(2.697±0.231)倍和(2.599±0.588)倍；mRNA的表達(dá)量分別為正常胰腺組織的7.01和4.63倍。胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達(dá)與腫瘤部位、分化程度、TNM分期、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)關(guān)。且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞Artemin、GFRα3陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞。結(jié)論Artemin、GFRα3參與胰腺癌的發(fā)生，兩者在胰腺癌組織中的高表達(dá)和胰腺癌嗜神經(jīng)性關(guān)系密切。

胰腺腫瘤； Artemin； GFRα3； 腫瘤轉(zhuǎn)移； 疼痛； 嗜神經(jīng)浸潤(rùn)

胰腺癌神經(jīng)轉(zhuǎn)移率高，且與頑固性腹痛密切相關(guān)，但胰腺癌嗜神經(jīng)性確切分子機(jī)制尚不清楚。作為膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)家族成員之一，Artemin及其受體GFRα1～4/RET的主要生理功能是促進(jìn)各種神經(jīng)性疾病的修復(fù)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，但它們?cè)谌艘认侔┙M織中的表達(dá)及與腫瘤神經(jīng)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究甚少。本研究檢測(cè)Artemin及受體GFRα3在胰腺癌組織中的表達(dá)，分析其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，探討其臨床意義。

資料與方法

一、臨床資料

收集日照市人民醫(yī)院病理科2001年10月至2009年10月手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本100例，均經(jīng)病理確診為胰腺導(dǎo)管癌。其中男性57例，女性43例，年齡34～72歲，平均(50±10)歲；按2002年UICC(第6版)胰腺癌TNM分期方法分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期35例，Ⅲ期31例，Ⅳ期22例；胰頭癌48例，胰體尾癌52例；術(shù)前均未行任何放、化療等治療。正常胰腺標(biāo)本取自因胃腸道、膽管或膽囊病變行胰十二指腸聯(lián)合切除術(shù)患者，共40例，男性27例，女性13例，年齡33～68歲，平均(47±9)歲。

二、病理學(xué)檢查

胰腺組織常規(guī)固定、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)外膜、束膜或內(nèi)膜下神經(jīng)周圍間隙有無(wú)癌細(xì)胞存在和(或)沿神經(jīng)周圍間隙擴(kuò)散。神經(jīng)浸潤(rùn)類型分為：侵入型(癌細(xì)胞侵入神經(jīng)束膜內(nèi))；圍神經(jīng)型(癌細(xì)胞圍繞神經(jīng)纖維生長(zhǎng))；近神經(jīng)型(神經(jīng)組織內(nèi)見(jiàn)癌細(xì)胞，其數(shù)量尚不足以圍繞神經(jīng)組織)；混合型(兩種或兩種以上)[1]。

三、Artemin、GFRα3蛋白檢測(cè)

采用常規(guī)免疫組化法。SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物工程技術(shù)有限公司，抗Artemin、GFRα3單克隆抗體分別購(gòu)自史瑞可生物(上海)有限公司和北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司。胞質(zhì)、胞膜著棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果判斷：40×10倍視野下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。著色強(qiáng)度按染色深度分：陰性0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。每例分值按文獻(xiàn)[2]計(jì)算，為陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)×著色強(qiáng)度+1。

四、Artemin、GFRα3 mRNA檢測(cè)

Trizol(Invitrogen公司)提取標(biāo)本總RNA，取2 μg總RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Artemin上游5′-TGGCCGCTCTGG-CTCTGCTGA-3′，下游5′-TGAGGTCTCTGG-TGTCTTTTAGG-3′，產(chǎn)物382 bp；GFRα3上游5′-ATT-GGCACAGTCATGACTCCCAAC-3′，下游5′-GAGGAGCAGCCATTGATTTTGTGG-3′，產(chǎn)物260 bp；內(nèi)參β-actin上游5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′，下游5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′，產(chǎn)物136 bp。引物均由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，69℃(Artemin)或65℃(GFRα3)或57℃(β-actin)30 s、72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收，送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序。另外，在ABI GeneAmp 5700儀上行實(shí)時(shí)PCR，反應(yīng)條件同上。通過(guò)儀器所帶軟件獲得相應(yīng)Ct值。mRNA 表達(dá)量通過(guò)公式2-△Ct計(jì)算，△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin。以正常胰腺組織的mRNA表達(dá)量為1，計(jì)算胰腺癌mRNA表達(dá)的倍數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織標(biāo)本神經(jīng)轉(zhuǎn)移情況

100例標(biāo)本中64例存在神經(jīng)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為64%，其中侵入型36例，圍神經(jīng)型12例，近神經(jīng)型4例，混合型12例(圖1)。

a：侵入型(×200)；b：圍神經(jīng)型(×400)；c：圍神經(jīng)組織并侵入神經(jīng)束膜(×200)；d：近神經(jīng)型(×200)

圖1胰腺癌的不同類型神經(jīng)轉(zhuǎn)移(HE)

二、胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

Artemin、GFRα3蛋白陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，主要定位于胰腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)，胞膜少量著色，部分神經(jīng)鞘膜呈GFRα3陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。Artemin、GFRα3在胰腺癌組織中的表達(dá)量分別為正常胰腺組織的(2.697±0.231)倍和(2.599±0.588)倍。在胰腺癌組織中，Artemin與GFRα3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.848,P<0.01)。

胰腺癌組織Artemin、GFRα3蛋白表達(dá)與腫瘤部位、分化程度、TNM分期、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)關(guān)(表1)。此外，靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞Artemin、GFRα3陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞。

圖2胰腺癌組織中Artemin(a)、GFRα3(b)表達(dá)(SABC ×200)

臨床病理特征例數(shù)ArteminGFRα3年齡(歲) <50452.346±0.2392.352±0.482 ≥50552.986±0.2252.801±0.674性別 男572.294±0.4022.447±0.523 女432.958±0.3842.715±0.670腫瘤大小(cm) ≤5362.365±0.3052.453±0.538 >5442.926±0.3422.742±0.623腫瘤部位 頭482.239±0.2642.253±0.692 體尾523.258±0.495a3.318±0.904a分化程度 高分化241.373±0.3121.464±0.537 中分化412.482±0.381a2.561±0.638a 低分化353.719±0.526b3.729±0.742b神經(jīng)轉(zhuǎn)移 無(wú)361.625±0.2831.836±0.762 有643.643±0.482b3.528±0.641b淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)461.458±0.4261.248±0.384 有543.729±0.583b3.626±0.643bTNM分期 Ⅰ～Ⅱ期472.163±0.3062.237±0.645 Ⅲ～Ⅳ期533.659±0.726b3.024±0.732a

注：aP<0.05,bP<0.01

三、 Artemin、GFRα3 mRNA的表達(dá)

Artemin和GFRα3測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。應(yīng)用NCBI Blast 2.2.16:Nucleotide sequence(BLAST Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行基因比對(duì)， Artemin序列與GenBank提供的定位于染色體1p32～p33區(qū)已知序列(N：AF115765)完全一致。GFRα3基因序列與GenBank提供的定位于染色體5q31.2～q32的已知序列(N：AF051767)亦完全一致。

圖3 Artemin基因測(cè)序圖(Forward)

圖4 GFRα3基因測(cè)序圖(Forward)

在Rn=0.01水平，Artemin、GFRα3 mRNA在胰腺癌組織中表達(dá)的數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，癌組織的Artemin、GFRα3 mRNA表達(dá)量分別為正常胰腺組織的7.01和4.63倍。

表2 正常及胰腺癌組織細(xì)胞中各基因表達(dá)的比較

注：△Ct為循環(huán)數(shù)差值

討 論

Artemin是GDNF 家族最晚被發(fā)現(xiàn)的成員，由113個(gè)氨基酸和7個(gè)保守的半胱氨酸殘基組成。Artemin與neurtuin(NTN)及persephin(PSP)有45%同源性，與GDNF 有大約30%的同源性。Artemin傾向于結(jié)合GFRα3受體，形成配基/受體復(fù)合物，通過(guò)糖基-磷脂酰肌醇(GPI) 錨定于細(xì)胞質(zhì)膜，激活Ret，從而傳遞信號(hào)。在胚胎發(fā)育中，腎、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、軟骨和肌肉細(xì)胞高水平表達(dá)Artemin。Artemin亦廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織中，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道[3]，GDNF可通過(guò)增加金屬蛋白酶9的活性而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲性。體外實(shí)驗(yàn)證明[4]，將表達(dá)GDNF mRNA 并分泌GDNF的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系與胰腺癌細(xì)胞系共同培養(yǎng)，胰腺癌細(xì)胞向膠質(zhì)和神經(jīng)性腫瘤細(xì)胞遷移能力大幅提高，且這種遷移與GDNF 的濃度明顯相關(guān)，用抗GDNF 抗體干預(yù)可明顯減弱這種遷移作用。神經(jīng)轉(zhuǎn)移與臨床分期、淋巴管浸潤(rùn)密切相關(guān)，造成頑固性腹痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[5-6]。

Ito等[7]報(bào)道，Artermin在胰內(nèi)神經(jīng)叢高表達(dá)。Ceyhan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Artemin和GFRα3/Ret主要定位于原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞、神經(jīng)束和動(dòng)脈壁上，在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)比正常胰腺組織明顯增加。Artemin的高表達(dá)可增加癌細(xì)胞的浸潤(rùn)侵襲能力高達(dá)5倍，但與胰腺癌性疼痛無(wú)相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺導(dǎo)管癌組織的神經(jīng)浸潤(rùn)率高達(dá)64%。Artemin、GFRα3的mRNA和蛋白的表達(dá)在胰腺癌中明顯高于正常胰腺組織，提示它們參與胰腺癌發(fā)生。Artemin表達(dá)在有神經(jīng)浸潤(rùn)組明顯高于無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)組，且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織的癌細(xì)胞，提示Artemin與胰腺癌神經(jīng)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。而胰體尾部癌Artemin表達(dá)水平明顯高于胰頭癌，部分解釋了臨床上胰體尾癌患者往往以腹部疼痛為主訴的原因。此外，Artemin表達(dá)水平與癌細(xì)胞分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示它有可能作為預(yù)測(cè)預(yù)后的靶標(biāo)之一。在胰腺癌組織中，GFRα3與Artemin表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)由胰腺癌細(xì)胞分泌的Artemin，一方面可能通過(guò)旁分泌途徑，與神經(jīng)鞘膜上的GFRα3受體結(jié)合，作用于神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)提供適宜的微環(huán)境和化學(xué)趨化性，促進(jìn)神經(jīng)軸突向腫瘤方向生長(zhǎng)，進(jìn)而造成癌細(xì)胞侵犯神經(jīng)纖維；另一方面，可能通過(guò)自分泌途徑，作用于癌細(xì)胞自身表面的GFRα3受體，通過(guò)Artemin-GFRα3生物軸系統(tǒng)，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

[1] 徐東波，孫保存.腺樣囊性癌的臨床病理分析及神經(jīng)浸潤(rùn)機(jī)制研究.2006年中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，2006，57．

[2] Zhigang Z,Wenlv S.Prostate stem cell antigen (PSCA) expression in human prostate cancer tissues:implications for prostate carcinogenesis and progression of prostate cancer.Jpn J Clin Oncol,2006,36:121.

[3] Funahashi H,Takeyama H,Sawai H,et al.Alteration of integrin expression by glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in human pancreatic cancer cells.Pancreas,2003,27:190-196.

[4] Bockman DE,Buchler M,Beger HG.Interation of pancreatic ductal carcinoma with nerve damage.Gastroenterology,1994,107:219-230.

[5] Hirai I,Kimura W,Ozawa K,et al.Perineural invasion in pancreatic cancer.Pancreas,2002,24:15-25.

[6] 程鵬,金鋼,胡先貴,等.新生淋巴管在胰腺導(dǎo)管腺癌周圍神經(jīng)叢微轉(zhuǎn)移過(guò)程中的機(jī)制研究.中華胰腺病雜志,2009,9:363-366.

[7] Ito Y, Okada Y, Sato M,et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family members and their receptors in pancreatic cancers.Surgery,2005,138:788-794.

[8] Ceyhan GO,Giese NA,Erkan M,et al.The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion.Ann Surg,2006,244:274-281.

2010-01-20)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandsignificanceofarteminanditsreceptorsGFRα3inpancreaticductaladenocarcinoma

MENGLing-xin,DINGZhao-jun,CHENXi-ping,FEILi-sheng,ZHANGHong,WANGXiao-fang.

DepartmentofOncological,RizhaoPeopleHospital,JiningMedicalCollege;RizhaoCancerTherapyCenter,Rizhao276826,China

MENGLing-xin,Email:menglx001623@163.com

ObjectiveTo investigate artemin and its receptors GFRα3 expression in human pancreatic ductal adenocarcinoma and its significance.MethodsExpression and distribution of artemin and GFRα3 in 100 cases of human pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) and 40 cases of normal pancreatic tissue were detected by immunohistochemistry and RT-PCR, quantitative RT PCR. Relations of artemin and GFRα3 with clinicopathological characteristics, especially nerve invasion were analyzed.ResultsNerve invasion was detected in 64 out of 100 cases of PDAC, and the rate of nerve invasion was 64%. The ratio of expression of Artemin, GFRα3 protein in PDAC/ normal pancreatic tissue was 2.697±0.231 and 2.599±0.588; the ratio of expression of Artemin, GFRα3 mRNA was 7.01 and 4.63. Artemin and GFRα3 expression were associated with tumor location, differentiation degree, TNM staging, nerve invasion node metastasis, but it was not associated with age, sex and tumor size. Artemin and GFRα3 expression was more positively expressed in cancer cells close to nerve tissue than cells far from nerve tissue.ConclusionsArtemin and GFRα3 were involved in the development of pancreatic cancer and their high expression was closely related to perineural invasion.

Pancreatic neoplasms; Artemin; GFRα3; Neoplasm metastasis; Pain; Perineural invasion

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.009

山東省自然科學(xué)基金(ZR2010 HL053)

276826 山東省日照市,濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬日照市人民醫(yī)院腫瘤科，日照市腫瘤治療中心(孟令新、丁兆軍、陳希平、費(fèi)立升、張紅);天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院國(guó)家“211工程”中心實(shí)驗(yàn)室(王曉芳)

孟令新,Email:menglx001623@163.com