褪黑素對(duì)急性壞死性胰腺炎合并腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

楊慧瑩 唐國(guó)都 蘇娟 覃蒙斌 梁志海 鐘衛(wèi)一

褪黑素對(duì)急性壞死性胰腺炎合并腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

楊慧瑩 唐國(guó)都 蘇娟 覃蒙斌 梁志海 鐘衛(wèi)一

急性腎功能衰竭是重癥急性胰腺炎(SAP)患者早期病死的主要原因之一。因此研究其發(fā)病機(jī)制并尋求有效的防治措施具有重要的臨床價(jià)值。Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌物受體的內(nèi)源性配體，它在急性胰腺炎(AP)發(fā)生發(fā)展中具有抑制炎癥的作用。本研究應(yīng)用褪黑素干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察腎組織Ghrelin和NF-κB p65表達(dá)及腎組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，探討褪黑素對(duì)腎損傷的作用機(jī)制。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～250 g。按完全隨機(jī)法分為對(duì)照組、ANP組和褪黑素干預(yù)組，每組24只。采用腹腔注射6% L-Arg溶液(1.5 g/kg體重)3次、間隔1 h的方法制備ANP模型。褪黑素組于首次注射L-Arg前30 min腹腔內(nèi)注射1%褪黑素50 μg/kg體重。對(duì)照組腹腔注射等容積生理鹽水。末次腹腔內(nèi)注射后6、12、24 h分批處死大鼠。觀察大鼠腹腔內(nèi)各臟器的變化，留取胰腺及腎組織，部分用10%甲醛固定，部分置-80℃保存，取血分離血清，-20℃保存。

2．胰腺和腎組織病理學(xué)檢查：由同一病理科醫(yī)師光鏡下觀察胰腺及腎組織病理變化，分別參考Kusske等[1]和雷文章等[2]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

3．腎組織Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用Trizol提取腎組織總RNA， RT-PCR檢測(cè)Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達(dá)。依據(jù)Gene Bank設(shè)計(jì)引物。NF-κB p65引物：5′-AGCTCAAGATCTGCCGAGTA-3′，5′-GATCTGCCCAGGTGGTAACAC-3′，擴(kuò)增片段556 bp，擴(kuò)增條件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min；Ghrelin引物：5′-GTGTCTTCAGCGACTATCT-3′，5′-CCTGTCAGTGGTTACTTGTT-3′，擴(kuò)增片段362 bp，擴(kuò)增條件95℃ 5 min，94℃ 1 min、56℃ 40 s、72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)， 72℃ 10 min；內(nèi)參β-actin引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′， 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增片段150 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)分析。

4．血清淀粉酶活性及IL-6水平測(cè)定：由全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定血清淀粉酶活性。應(yīng)用ELISA試劑盒測(cè)定血清IL-6水平。

5．腎組織MDA、MPO、SOD含量測(cè)定：應(yīng)用ELASA法測(cè)定丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)含量，按試劑盒說明書操作。

二、結(jié)果

1．胰腺及腎組織病理變化：對(duì)照組胰腺肉眼觀無變化，鏡下見胰腺腺泡結(jié)構(gòu)完整。 ANP組胰腺外觀為灰白色、水腫明顯,部分有暗紅色出血樣改變；鏡下見胰腺腺泡水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 腺小葉結(jié)構(gòu)消失,灶性壞死、出血，病理變化隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。褪黑素組胰腺外觀稍白，水腫，無出血樣改變；鏡下見腺泡輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腺泡細(xì)胞壞死、出血。胰腺病理評(píng)分見表1。

對(duì)照組腎臟大體未見明顯異常，鏡下腎皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。ANP組腎臟體積略大， 12 h后外觀呈暗紫色，24 h更明顯；鏡下見腎小球淤血，細(xì)胞腫脹，管腔擴(kuò)大，部分小管上皮壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見管型，病理變化隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。褪黑素組腎臟大體改變與ANP無明顯差別；鏡下見腎小管細(xì)胞腫脹，偶見小管上皮壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。腎臟病理評(píng)分見表1。

2．血清淀粉酶及IL-6水平變化：ANP組大鼠血清淀粉酶及IL-6水平均較對(duì)照組顯著升高(P值均<0.05)；褪黑素組較同時(shí)點(diǎn)ANP組明顯降低(P值均<0.05，表1)。

3．腎組織MDA、MPO、SOD含量變化：ANP組腎組織MDA、MPO含量較對(duì)照組顯著升高(P值均<0.05)，而SOD含量較對(duì)照組明顯降低(P值均<0.05)；褪黑素組腎組織MDA、MPO含量較同時(shí)間點(diǎn)ANP組明顯降低(P值均<0.05)，而SOD含量較ANP組明顯升高(P值均<0.05，表1)。

表1 各組大鼠胰腺和腎臟病理評(píng)分、血清淀粉酶和IL-6含量及腎臟MDA、MPO、SOD含量變化

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

4．腎臟Ghrelin、NF-κB p65 mRNA表達(dá)的變化： ANP組Ghrelin mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，且呈時(shí)間依賴性降低；褪黑素組Ghrelin mRNA表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)ANP組明顯增加。ANP組NF-κB p65 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，且呈時(shí)間依賴性；褪黑素組NF-κB p65 mRNA表達(dá)較同時(shí)間點(diǎn)ANP組明顯降低(P<0.05，圖1,表2)。

討論目前認(rèn)為細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的持續(xù)過量釋放是導(dǎo)致ANP持續(xù)發(fā)展并造成急性腎功能衰竭的重要原因[3]。IL-6是炎性刺激下多種細(xì)胞釋放的介導(dǎo)急性時(shí)相反應(yīng)的主要炎癥因子，是早期評(píng)價(jià)AP嚴(yán)重程度的最佳指標(biāo)[4]。NF-κB是一類主要參與機(jī)體炎性分子表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種原因引起的組織損傷[5]。ANP發(fā)生后，NF-κB活化，可增強(qiáng)TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，使其產(chǎn)生和釋放增多，繼而再次激活NF-κB,又使IL-6和IL-8產(chǎn)生和釋放增多，放大最初炎癥信號(hào)，產(chǎn)生瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成腎臟結(jié)構(gòu)及功能的損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠血清IL-6大量產(chǎn)生，且腎臟NF-κB p65 mRNA表達(dá)也顯著增加，提示IL-6及NF-κB p65參與ANP時(shí)對(duì)腎臟損傷作用的機(jī)制。

C：對(duì)照組；A：ANP組；M：褪黑素組

組 別只數(shù)時(shí)間NF?κBp65mRNAGhrelinmRNA對(duì)照組86h0．39±0．060．68±0．08812h0．39±0．080．66±0．06824h0．31±0．040．69±0．07ANP組86h0．57±0．06a0．48±0．05a812h0．75±0．06a0．34±0．04a824h0．79±0．04a0．29±0．04a褪黑素組86h0．47±0．04ab0．56±0．04ab812h0．58±0．07ab0．57±0．07ab824h0．45±0．05ab0．59±0．07ab

注:與對(duì)照組比較,aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的降解產(chǎn)物，直接反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度；MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其表達(dá)水平代表著嗜中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)[6]。而SOD是一種重要的氧自由基清除劑[7]。ANP發(fā)生時(shí)，腎組織微循環(huán)障礙、缺血缺氧，積存在腎小管內(nèi)的大量脫落上皮細(xì)胞碎片及紅細(xì)胞碎片趨化大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生，后者通過脂質(zhì)過氧化和共價(jià)鍵結(jié)合等作用進(jìn)一步損傷腎臟結(jié)構(gòu)及功能[8]。本結(jié)果顯示，隨著ANP的進(jìn)展，腎臟MDA、MPO含量逐漸升高，而SOD含量降低，考慮可能與ANP時(shí)腎組織大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)劑氧自由基增多大量消耗SOD有關(guān)。

Ghrelin是大鼠胃組織中發(fā)現(xiàn)的一種多肽[9]，分布在整個(gè)胃腸道、肝臟、胰島、腎臟中。目前不少研究證實(shí)，外源性Ghrelin在AP合并胰外器官損傷時(shí)能發(fā)揮抗炎抗氧化的保護(hù)作用[10]。本結(jié)果顯示，ANP組腎臟Ghrelin mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性遞減，可能為ANP時(shí)大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)及脂質(zhì)過氧化作用等導(dǎo)致了腎臟損傷，使腎臟ghrelin mRNA合成受阻。

褪黑素是松果體分泌的主要激素，能有效地清除多種氧自由基[11]，抑制各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的生成[12]。本結(jié)果顯示，外源性給予褪黑素后ANP大鼠的腎臟病理損傷減輕，腎臟NF-κB p65 mRNA表達(dá)減少，Ghrelin mRNA表達(dá)增加，MDA、MPO含量降低，SOD含量增加，提示外源性褪黑素可能通過抑制NF-κB p65的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的生成和釋放，并可能通過增加Ghrelin mRNA表達(dá)，清除多種氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用，從而減輕腎損傷。

[1] Kusske AM, Rongione AJ, Ashley SW, et al. Interleukin-10 prevents death in lethal necrotizing pancreatitis in mice. Surgery, 1996,120: 284-288.

[2] 雷文章,韋靖江,沈文律,等.實(shí)驗(yàn)性壞死性胰腺炎多器官損害與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1995,12:131-132.

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[8] Closa D,Rosello-Catafau J,Martrat A,et al.Changes of systemic in prostacyclin and thromboxane A2 in sodium taurocholate and cerulein-induced acute pancreatitis in rats.Dig Dis Sci,1993,38:33-38.

[9] Kojima M, Hosoda H, Date Y,et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature,1999,402:656-660.

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[12] Duelli D,Lazebnik Y.Cell fusion:a hidden enemy? Cancer Cell,2003,3:445-448.

2010-11-11)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.022

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科自0728107)

530021 廣西南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

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