葡萄籽原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

周 恒, 林煥冰,卓燁燁,畢炳添,李國(guó)熊,徐江平

(1．南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)科，廣東 廣州 510515；2．廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣東 廣州 510080)

葡萄籽原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

周 恒1, 林煥冰2,卓燁燁1,畢炳添1,李國(guó)熊1,徐江平1

(1．南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)科，廣東 廣州 510515；2．廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，廣東 廣州 510080)

目的觀察葡萄籽原花青素(GSP)對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法采用改良Pulsinelli四血管阻塞法建立VD大鼠模型，造模成功后，每天灌胃給藥，Wistar大鼠分為假手術(shù)組，模型組，原花青素組(50 mg/kg和150 mg/kg)，銀杏葉片24 mg/kg。Morris水迷宮檢測(cè)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；比色法檢測(cè)腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測(cè)海馬Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，原花青素可明顯改善VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；提高腦組織SOD活性、GSH含量和總抗氧化能力，降低MDA含量；提高海馬Bcl-2/Bax mRNA比值。結(jié)論原花青素可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與提高機(jī)體抗氧化能力、抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

原花青素；血管性癡呆；氧化應(yīng)激 ；凋亡

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能障礙綜合征。我國(guó)65歲以上老年人的血管性癡呆患病率約為1.1%[1]，隨著人口老齡化的加劇和卒中治療死亡率的降低，血管性癡呆的患病率持續(xù)上升，尋找有效的治療藥物已成為研究的熱點(diǎn)。

葡萄籽原花青素有著極強(qiáng)的抗氧化及清除活性自由基能力，其保護(hù)心血管、防治癌癥、抗炎、抗輻射、提高學(xué)習(xí)記憶等藥理作用一直受到研究重視[2]。之前的研究顯示，原花青素有抗小鼠血管性癡呆的作用[3]，能抵抗因H2O2氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[4]。本研究就葡萄籽原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響進(jìn)行研究，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1藥品與材料 原花青素(葡萄籽提取物，上?？稻呕び邢薰荆ㄇ嗨氐途垠w含量≧95%)；銀杏葉提取物(上海杏林科技藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)080908)；超氧化物歧化酶、總抗氧化能力、丙二醛、還原型谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20091111)；TRIzol(Invitrogen)、PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Premix EX TaqTM(TaKaRa), Biometra Tgradient PCR儀，Stratagene Mx3000P 熒光定量PCR儀，Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.2動(dòng)物分組 Wistar大鼠50只，雄性，220～250 g，許可證號(hào)SCXK粵2006-0015，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，原花青素低劑量組50 mg/kg，原花青素高劑量組150 mg/kg，銀杏葉片組24 mg/kg，動(dòng)物自由覓食飲水，自然光照。

1.3方法 采用改良Pulsinelli四血管阻塞法制作VD模型[5]。動(dòng)物用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，頸正中切口并分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，置4號(hào)絲線備用。暴露第一頸椎兩側(cè)翼孔，用直徑0.5 mm的電凝針灼燒兩側(cè)翼孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，使椎動(dòng)脈閉塞。術(shù)后24 h，在動(dòng)物清醒狀態(tài)下將其固定，兩側(cè)頸總動(dòng)脈分別用無創(chuàng)性小動(dòng)脈夾夾住，造成全腦缺血。模型成功標(biāo)準(zhǔn)為：夾閉1 min后翻正反射消失，動(dòng)物僵直無反應(yīng)，毛發(fā)豎立，眼發(fā)白。缺血10 min后，松開動(dòng)脈夾，縫合后回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和翼孔，不作缺血處理。取造模成功的大鼠每天灌胃給藥，給藥體積為1 ml/100 g，藥物用1%CMCNa配置成混懸液，假手術(shù)組和模型組給予1%CMCNa溶液。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 術(shù)后第15天給藥30 min后開始Morris水迷宮測(cè)試[6]，訓(xùn)練時(shí)將大鼠面向池壁放入水中，待大鼠找到平臺(tái)之后，讓其在平臺(tái)上停留10 s，如果大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)停留10 s，每天3個(gè)位點(diǎn)入水，連續(xù)訓(xùn)練5 d。第6天撤去平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間。

1.5腦組織SOD活性、MDA、GSH含量和T-AOC變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠麻醉處死，按試劑盒方法進(jìn)行操作，檢測(cè)全腦SOD活性、MDA、GSH含量及T-AOC，考馬斯亮藍(lán)法標(biāo)定蛋白含量。

1.6Real-time PCR檢測(cè)海馬Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá) 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法，抽取4只大鼠海馬，按TRIzol抽提試劑盒說明書提取RNA。按PrimeScriptTM RT試劑盒操作合成cDNA。β-actin引物序列AGAGGGAAATCGTGCGTGAC/CCATACCCAGGAAGGAAGGCT，產(chǎn)物長(zhǎng)度195 bp，Bax 引物序列GGCCCACCAGCTCTGAACAG/GCAATCATCCTCTGCAGCTCCATATTA，產(chǎn)物長(zhǎng)度為208 bp，Bcl-2引物序列TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC/TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC，產(chǎn)物長(zhǎng)度119bp 。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。根據(jù)Mx 3 000 P提供的CT值，△CT = CTGene- CTβ-actin,△△CT = △CTtreated- △CTcontrol,通過相對(duì)定量法(2-△△CT),計(jì)算各基因mRNA表達(dá)水平,并計(jì)算各組與假手術(shù)組的比值。

2 結(jié)果

2.1原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響 表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，VD大鼠出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，撤去平臺(tái)后的空間探索實(shí)驗(yàn)中，穿越平臺(tái)次數(shù)和在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比明顯降低(P<0.01)。原花青素(50和100 mg/kg)能明顯縮短大鼠的逃避潛伏期，增加穿臺(tái)次數(shù)和大鼠在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比，表明原花青素能明顯改善血管性癡呆大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能(P<0.05或P<0.01)。

表1 原花青素對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

注：1)P<0.05,2)P<0.01,與模型組比較。

2.2原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠抗氧化能力的影響 由表2數(shù)據(jù)可以看出，與假手術(shù)組相比，VD大鼠腦組織GSH含量降低、SOD活性降低、T-AOC降低、MDA含量升高(P<0.01)。原花青素(50和150 mg/kg)均可提高血管性癡呆大鼠腦組織GSH含量、SOD活性和總抗氧化能力，降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。

2.3原花青素對(duì)血管性癡呆大鼠海馬Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 由表3數(shù)據(jù)可知，與假手術(shù)組相比，VD大鼠海馬Bax mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。原花青素(50和150 mg/kg)可下調(diào)血管性癡呆大鼠海馬Bax mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)(P<0.01)，使Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的值顯著上升(P<0.01)。

表2 原花青素對(duì)VD大鼠腦組織GSH、SOD、MDA、T-AOC的影響

注：1)P<0.05,2)P<0.01,與模型組比較。

表3 原花青素對(duì)VD大鼠海馬Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

注：1)P<0.05,2)P<0.01,與模型組比較。

3 討論

理想的VD動(dòng)物模型應(yīng)與臨床VD人腦的病理損害相一致，且伴有動(dòng)物智能損害，本研究采用的Pulsinelli四血管阻塞法是目前較為公認(rèn)的VD造模方式，它可高度模擬VD的發(fā)病特點(diǎn)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)動(dòng)物的認(rèn)知能力，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的研究[7]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)VD大鼠與假手術(shù)組相比，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)；空間探索實(shí)驗(yàn)中，VD大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和平臺(tái)所在象限探索時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比較假手術(shù)組都明顯減少，顯示VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降。與模型組相比，原花青素能顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

原花青素能夠清除自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力，其自由基清除作用可能為廣譜的抗自由基能力[8]。SOD活性可以間接反映清除自由基的能力，MDA的含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，提示自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度。GSH能清除自由基，穩(wěn)定巰基酶，減輕過氧化對(duì)機(jī)體的損害，GSH含量也能衡量機(jī)體的抗氧化能力。T-AOC代表體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的總體水平，可綜合反映組織對(duì)抗自由基對(duì)脂質(zhì)膜的損害和清除活性氧的能力。與假手術(shù)組相比，VD大鼠腦組織SOD活性、GSH含量和T-AOC明顯降低，MDA含量明顯升高，提示氧化抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失去平衡。原花青素可提高腦組織SOD活性、GSH含量，緩解T-AOC降低，減少M(fèi)DA的生成，改善自由基代謝表現(xiàn)出抗氧化作用,其作用機(jī)制與銀杏葉提取物類似[9]。

大腦缺血缺氧是VD的重要病因，海馬是缺血性腦損傷最敏感的腦區(qū)之一。VD患者海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯減少，彌散性或局灶性腦缺血引起海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死與凋亡是其主要因素[10]。Bcl-2家族蛋白調(diào)控著線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡的主開關(guān)作用[11]。Bcl-2基因表達(dá)的Bcl-2蛋白是定位在內(nèi)膜系統(tǒng)上包括線粒體膜上的一種凋亡調(diào)控蛋白，可以與線粒體膜上的電壓依賴性陽離子通道結(jié)合來調(diào)節(jié)促凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放，也可以和Bax蛋白結(jié)合，阻斷其插入到線粒體膜上來維持線粒體的膜電位，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax具有促細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax值決定細(xì)胞接受凋亡刺激信號(hào)后的存活狀態(tài)[12]。與假手術(shù)組相比，VD大鼠海馬Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低，Bax mRNA表達(dá)升高，原花青素可上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值明顯高于模型組，提示原花青素具有抗凋亡作用，后期神經(jīng)元凋亡可能少于模型組，但還需Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的蛋白水平測(cè)定確證。此外，腦組織內(nèi)抗氧化與抗凋亡之間的聯(lián)系也有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與提高機(jī)體抗氧化能力、抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)，這為原花青素作為血管性癡呆治療藥物提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2011-01-07

[修回日期] 2011-03-13

Effectsofgrapeseedprocyanidinsonspatiallearningandmemoryinvasculardementiamodelofrats

ZHOU Heng1，LIN Huan-bing2，ZHUO Ye-ye1，Bi Bing-tian1，Li Guo-xiong1，XU Jiang-ping1

(1．Department of Neuropsychopharmacology, School of Pharmacy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China；2．Center for evaluation & certification, Guangdong food and drug administration, Guangzhou 510080, China)

ObjectiveTo investigate the effects and possible mechanisms of procyanidins, a polyphenol extracted from grape seeds, on spatial learning and memory in rats model of vascular dementia(VD).MethodsModified Pulsinelli's 4-vessel occlusion (4-VO) method was used for replicating vascular dementia in rats. The male Wistar rats were divided equally into 5 experimental groups: in one the rats were subjected to sham-operated, and in the other four the rats was subjected to the 4-VO surgery followed by oral administration of vehicle, Ginkgo leaf extract(24 mg/kg), procyanidins(50 or 150 mg/kg) respectively. The spatial learning and memory performance was recorded as the acquisition trial and probe trial in the Morris water maze. The levels of malondialdehyde(MDA), glutathione(GSH), total antioxidant capacity(T-AOC) and the activity of superoxidedismutase(SOD) in the brain tissue were determined by colorimetric Assay Kit. The gene expression of Bax and Bcl-2 in the rat hippocampus was detected by real-time PCR.ResultsThe vascular dementia rats treated with procyanidins showed decreased escaped latency during acquisition training, especially at the dose of 150 mg/kg, procyanidins also increased exploration time and frequency of crossing in the target quadrant during probe trial. The administration of procyanidins induced increase in GSH, T-AOC contents and SOD activities with lowering MDA levels in the brain. In addition, procyanidins upregulated the Bcl-2/Bax ratio of mRNA expression in the rat hippocampus.ConclusionProcyanidins could have potentials for improving the spatial cognition with VD，which was possibly due to the antioxidative and anti-apoptotic effects of polyphenol.

procyanidins; vascular dementia; oxidative stress;apoptosis

周 恒(1987-)，男，碩士研究生.E-mail:zhouheng.555@163.com.

徐江平. Tel：(020)61648236，E-mail:jpx@fimmu.com.

R965.1

A

1006-0111(2011)03-0208-04