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    溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的影響

    2011-11-22 02:13:04仡,童涌,楊
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:工程菌溶氧菌體

    岑 仡,童 涌,楊 峰

    (1.上海三維生物技術(shù)有限公司,上海 201206; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)無機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)

    溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的影響

    岑 仡1,童 涌1,楊 峰2

    (1.上海三維生物技術(shù)有限公司,上海 201206; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)無機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)

    目的確定rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的最佳溶氧濃度。方法通過通入純氧,高密度發(fā)酵的溶氧值可以精確控制。考察不同溶氧濃度對工程菌的生長、質(zhì)粒丟失率、乙酸積累情況以及rhG-CSF表達(dá)的影響,來確定溶氧的最佳控制范圍。結(jié)果工程菌生長階段溶氧控制在25%,誘導(dǎo)后控制在35%,最有利于菌體生長和外源蛋白表達(dá),最終菌體密度為(79.6±2.1)g/L,表達(dá)量為(40.2±1.2)%。結(jié)論溶氧對工程菌rhG-CSF高密度發(fā)酵有顯著影響。

    rhG-CSF; 高密度發(fā)酵; 溶氧

    粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是目前已知血細(xì)胞集落刺激因子中特異作用粒系祖細(xì)胞,促進(jìn)其向成熟中性粒細(xì)胞增殖、分化,并維持其功能、存活的造血生長因子。它對于治療由腫瘤放化療、骨髓移植所引起的粒細(xì)胞減少癥具有顯著療效[1]。由于rhG-CSF天然來源非常有限,利用基因工程重組技術(shù),進(jìn)行工程菌高密度發(fā)酵是大量獲取有藥用價(jià)值hG-CSF的一條重要途徑[2]。

    溶氧是影響高密度發(fā)酵的一個(gè)重要參數(shù)。工程菌在生長過程中,需要大量的氧氣參與代謝,因而氧的供給非常重要。溶氧濃度過高或過低,都會(huì)影響菌體的生長和產(chǎn)物合成[3]。不同溶氧濃度(DO)對高密度發(fā)酵中的菌體生長、外源質(zhì)粒丟失、乙酸的生成都會(huì)造成不同的影響,而這些因素又直接影響到外源蛋白的產(chǎn)量高低。本研究通過不同DO對上述3個(gè)因素影響的研究,最終確定了rhG-CSF工程菌pBVQG8/ MM294最適生長和最適表達(dá)的溶氧濃度,分別為25%和35%,為大規(guī)模生產(chǎn)rhG-CSF奠定了基礎(chǔ)。在確定了最適溶氧濃度后,rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵最終獲得菌體80 g/L,表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的40%。

    1 材料與方法

    1.1工程菌 工程菌pBVQG8/ MM294由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院構(gòu)建,上海三維生物技術(shù)有限公司保存,受PRPL雙重啟動(dòng)子控制,能在42 ℃下表達(dá)rhG-CSF,具有氨芐抗性。

    1.2培養(yǎng)基 ①種子培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基[4];②基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨 12 g/L、酵母膏 24 g/L、甘油 4 ml/L、KH2PO42.31 g/L、K2HPO412.54 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO40.2 g/L、微量元素[5]3 ml/L;③補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖 500 g/L、MgSO40.2 g/L、100 g/L蛋白胨。

    1.3發(fā)酵方法

    1.3.1種子液制備 取甘油管1支,接種于LB培養(yǎng)基中,在28 ℃ 200 r/min下培養(yǎng)至OD600(波長600 nm處的吸光值)到0.5~0.7之間。再以2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中,在28℃ 200 r/min下培養(yǎng)至OD600到0.5~0.7之間接種于發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。

    1.3.2高密度發(fā)酵 采用分批補(bǔ)料方式[6]。當(dāng)發(fā)酵過程中殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L后,開始補(bǔ)料,控制殘?zhí)菨舛葹? g/L。pH控制為7.0,生長階段溫度控制為28 ℃,誘導(dǎo)溫度控制為42 ℃。

    1.4檢測方法 ①菌體濃度測定:可見光分光光度計(jì)在λ=600 nm處測吸光值。②發(fā)酵液中葡萄糖濃度測定:使用Roche公司生產(chǎn)的血糖儀進(jìn)行檢測。③表達(dá)量的測定:發(fā)酵液菌體做聚丙烯酰胺凝膠電泳,掃描測定rhG-CSF表達(dá)量。④乙酸測定:HPLC法,參照文獻(xiàn)[7]方法。⑤質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測參照文獻(xiàn)[8]方法。

    2 結(jié)果與討論

    2.1溶氧控制失敗與成功的高密度發(fā)酵比較 設(shè)定控制溶氧為30%進(jìn)行發(fā)酵,隨著補(bǔ)料的進(jìn)行,菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后,發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量設(shè)定至最大值,但是DO仍無法控制在30%,DO隨著發(fā)酵的進(jìn)行,不斷下降,直至降為0。生長曲線與溶氧值及乙酸生成情況見圖1,當(dāng)DO降為0后,菌體的OD600值增加速率明顯減緩,甚至不增加,檢測最終發(fā)酵液中的乙酸含量達(dá)到9.2 g/L,已經(jīng)達(dá)到對菌體生長抑制的濃度。這說明溶氧值對大腸桿菌高密度發(fā)酵至關(guān)重要。要解決溶解氧的問題,必須增加純氧供氣,來滿足發(fā)酵過程菌體對氧的需求。

    圖1 溶氧控制失敗的生長情況

    設(shè)定控制溶氧為 30%進(jìn)行發(fā)酵,當(dāng)溶氧控制不住的時(shí)候,改用純氧通氣,使溶氧值始終控制在30%。發(fā)酵結(jié)果:OD600值達(dá)到了75,乙酸最終累積濃度也只有1.23 g/L。

    由圖2可以看出,DO控制成功與否,對于工程菌生長有的顯著的影響。DO控制成功后,發(fā)酵液的OD600可從40左右提高到了75。乙酸積累從原先的9.2 g/L下降到1.23 g/L,未達(dá)到抑制菌體生長的濃度。

    圖2 溶氧控制失敗與成功的菌體生長曲線

    通過上述實(shí)驗(yàn)的比較,說明DO對于rhG-CSF發(fā)酵是至關(guān)重要的,但最適DO還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察進(jìn)行確定。

    2.2溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵生長階段的影響 分別控制不同的溶氧濃度(5%~40%),進(jìn)行不誘導(dǎo)高密度發(fā)酵,培養(yǎng)9 h后,取樣,分別測定發(fā)酵液OD600、乙酸含量、質(zhì)粒穩(wěn)定性。

    在DO控制在5%~25%之間時(shí),發(fā)酵最終光密度隨著DO的升高也不斷升高。當(dāng)DO在25%~30%之間時(shí),發(fā)酵液的OD600值也達(dá)到最高值75左右。隨后OD600隨著DO的增加而減少,此種減少可能是由于供氧過高而導(dǎo)致前期菌體快速生長,導(dǎo)致其他的營養(yǎng)物質(zhì)過早耗竭,最終使菌體過早衰老,并發(fā)生菌體自溶所致,見圖3。

    圖3 不同DO值下的菌體密度

    發(fā)酵過程中, 追求高溶氧水平未必能得到高表達(dá)效果。如Meyer和 Fiechter發(fā)現(xiàn), 用枯草桿菌生產(chǎn)A干擾素時(shí), 溶氧限制在較低水平對產(chǎn)物形成有利[9],可能是在高溶氧濃度下,菌體生理代謝活性較強(qiáng), 比生長速率較快, 而質(zhì)粒復(fù)制速度趕不上菌體生長速度, 質(zhì)??截悢?shù)減少, 造成質(zhì)粒穩(wěn)定性降低,質(zhì)粒丟失, 最終影響蛋白產(chǎn)量。所以溶氧對工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響必須進(jìn)行考察,見圖4。隨著DO值的上升,質(zhì)粒穩(wěn)定率也不斷下降,當(dāng)溶氧值大于30%后,質(zhì)粒穩(wěn)定率下降的更加明顯。

    溶氧濃度過低會(huì)弱化TCA循環(huán), 改變轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)基因與葡萄糖和乙酸代謝[10], 導(dǎo)致乙酸大量積累。有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)發(fā)酵液中的乙酸濃度高于5~10 g/L時(shí)[11],會(huì)對菌體生長產(chǎn)生抑制作用, 降低生物量和蛋白產(chǎn)量。因此不同DO下的乙酸積累濃度也必須進(jìn)行考察,結(jié)果見圖5。發(fā)酵液中的乙酸濃度,隨著DO的上升,不斷降低。溶氧值在5%時(shí),乙酸積累濃度高達(dá)7.2 g/L,達(dá)到抑制菌體生長的濃度,當(dāng)DO值超過10%之后,發(fā)酵液中的乙酸積累量都達(dá)不到抑制所需要的濃度。

    圖4 不同DO值下的質(zhì)粒穩(wěn)定性

    圖5 不同DO下的乙酸積累情況

    通過對菌體密度、質(zhì)粒穩(wěn)定性和乙酸積累濃度三方面的考察以及綜合評定,確定了菌體生長階段的最適溶氧濃度為25%。

    2.3不同DO對rhG-CSF表達(dá)的影響 將工程菌種子液接種于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,控制溫度28 ℃,pH 7.0,進(jìn)行高密度發(fā)酵,生長階段DO控制在25%,當(dāng)OD600值到達(dá)30左右時(shí),然后控制不同的溶氧濃度(5%~45%)下,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果見圖6。表達(dá)量隨著所控制的溶氧值升高而升高,當(dāng)DO值到達(dá)35%后,表達(dá)量基本趨于穩(wěn)定,在40%左右??紤]到節(jié)約攪拌動(dòng)力和氧氣用量,筆者決定誘導(dǎo)后溶氧值控制在35%。

    2.4穩(wěn)定性研究 確定好的最適溶氧濃度運(yùn)用于rhG-CSF高密度發(fā)酵中,重復(fù)進(jìn)行3批發(fā)酵,考察其穩(wěn)定性。發(fā)酵條件為溫度28 ℃,溶氧25%、pH7.0,當(dāng)OD600值達(dá)到30左右時(shí),迅速將培養(yǎng)溫度升至42 ℃,同時(shí)控制溶氧濃度為35%。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果見表1,得到基本一致的結(jié)果。

    圖6 不同DO值下的表達(dá)量

    批號誘導(dǎo)OD600最終OD600表達(dá)量(%)菌體量(g/L)F00128.245.840.582F00229.247.141.279F00330.346.538.978

    圖7 3批發(fā)酵菌體電泳圖譜

    2.5結(jié)論 通過在不同溶氧值下工程菌pBVQG8/ MM294高密度發(fā)酵下的菌體生長、質(zhì)粒丟失率、乙酸積累濃度、rhG-CSF表達(dá)量的考察,確定了工程菌生長階段和誘導(dǎo)階段的最適溶氧濃度,分別為25%和35%。通過對溶氧濃度的優(yōu)化,工程菌pBVQG8/ MM294高密度發(fā)酵最終OD600值為45,菌體量為80 g/L,rhG-CSF表達(dá)量為40%。

    [1] 張 力,李龍蕓,林宏英,等,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腫瘤患者白細(xì)胞的影響[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2001,10(4):207.

    [2] 烏 垠,楊 紅,陸 軍,等,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表達(dá)研究[J].東北師大學(xué)報(bào)2000,32(4):46.

    [3] 李 寅,高海軍,陳 堅(jiān).高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006: 4.

    [4] 盧圣棟,主編.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M],北京:高等教育出版社,1993:590.

    [5] Yee L, Blanch HW. Recombinant trypsin production in high cell density fed-batch cultures in Escherichia coli[J]. Biotechnol Bioeng, 1993, 41(8): 781.

    [6] 俞俊棠,唐孝宣.生物工藝學(xué)[M].上海:華東化工學(xué)院出版社,1994.

    [7] Suare DC, Kilikian BV. Acetic acid accumulation in aerobic growth of recombinant Escherichia coli[J]. Process Biochemistry, 2000, 35: 1051.

    [8] 常海燕,范代娣,駱艷娥. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2009, 36(6): 870.

    [9] Meyer HP, Iechter AF. Production of cloned human leukocyt interferon by Bacillus subtilis: Optimal production is connected with rest rained growth[J]. Appl Environ Mi-crobiol, 1985, 50: 503.

    [10] Phue J.N, Shiloach J. Impact of dissolved oxygen concentration on acetate accumulation and physiology of E. coli BL21, evaluating transcription levels of key genes at different dissolved oxygen conditions[J]. Metabolic Engi-neering, 2005, 7: 353.

    [11] Yee L, Blanch HW. Recombinant trypsin production in high cell density fed-batch cultures in Escherichia coli[J]. Biotechnol Bioeng, 1993, 41(8): 781.

    2011-01-22

    [修回日期] 2011-04-22

    EffectofdissolvedoxygenonhighdensityfermentationofE.coliinproducingrhG-CSF

    CEN Yi1, YANG Feng2,TONG Yong1

    (1.Shanghai Sunwaybio Company, Shanghai 201206,China;2.Department of Inorganic Chemistry,School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    ObjectiveTo study the density of the dissolved oxygen(DO) on fermentation of E.coli in producing rhG-CSF.MethodsPure oxygen was used to control DO precisely and to observe the growth of engineered bacteria, the lost of plasmids ,the accumulation of acetic acid from different DO density. The optimum density of DO for fermentation was determined.Results25% in growth phase and 30% after induction was optimum density of DO for rhG-CSF expression and engineered bacteria growth. Under these conditions, the wet cell weight reached(79.6±2.1) g/L and the expression of rhG-CSF was(40.2±1.2)%.ConclusionsThe growth of engineered bacteria and the expression of rhG-CSF were influenced by the density of dissolved oxygen significantly.

    rhG-CSF; high density fermentation; dissolved oxygen

    上海市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目[98-0075(5)].

    岑 仡(1974-),男,執(zhí)業(yè)藥師.共同第一作者:童 涌(1972-),男,碩士,執(zhí)業(yè)藥師.

    楊 峰.Tel: (021)81871220, E-mail: yangfeng1008@sohu.com.

    R966

    A

    1006-0111(2011)03-0197-04

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