• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的影響

    2011-11-22 02:13:04仡,童涌,楊
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:工程菌溶氧菌體

    岑 仡,童 涌,楊 峰

    (1.上海三維生物技術(shù)有限公司,上海 201206; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)無機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)

    溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的影響

    岑 仡1,童 涌1,楊 峰2

    (1.上海三維生物技術(shù)有限公司,上海 201206; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)無機(jī)化學(xué)教研室,上海 200433)

    目的確定rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵的最佳溶氧濃度。方法通過通入純氧,高密度發(fā)酵的溶氧值可以精確控制。考察不同溶氧濃度對工程菌的生長、質(zhì)粒丟失率、乙酸積累情況以及rhG-CSF表達(dá)的影響,來確定溶氧的最佳控制范圍。結(jié)果工程菌生長階段溶氧控制在25%,誘導(dǎo)后控制在35%,最有利于菌體生長和外源蛋白表達(dá),最終菌體密度為(79.6±2.1)g/L,表達(dá)量為(40.2±1.2)%。結(jié)論溶氧對工程菌rhG-CSF高密度發(fā)酵有顯著影響。

    rhG-CSF; 高密度發(fā)酵; 溶氧

    粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是目前已知血細(xì)胞集落刺激因子中特異作用粒系祖細(xì)胞,促進(jìn)其向成熟中性粒細(xì)胞增殖、分化,并維持其功能、存活的造血生長因子。它對于治療由腫瘤放化療、骨髓移植所引起的粒細(xì)胞減少癥具有顯著療效[1]。由于rhG-CSF天然來源非常有限,利用基因工程重組技術(shù),進(jìn)行工程菌高密度發(fā)酵是大量獲取有藥用價(jià)值hG-CSF的一條重要途徑[2]。

    溶氧是影響高密度發(fā)酵的一個(gè)重要參數(shù)。工程菌在生長過程中,需要大量的氧氣參與代謝,因而氧的供給非常重要。溶氧濃度過高或過低,都會(huì)影響菌體的生長和產(chǎn)物合成[3]。不同溶氧濃度(DO)對高密度發(fā)酵中的菌體生長、外源質(zhì)粒丟失、乙酸的生成都會(huì)造成不同的影響,而這些因素又直接影響到外源蛋白的產(chǎn)量高低。本研究通過不同DO對上述3個(gè)因素影響的研究,最終確定了rhG-CSF工程菌pBVQG8/ MM294最適生長和最適表達(dá)的溶氧濃度,分別為25%和35%,為大規(guī)模生產(chǎn)rhG-CSF奠定了基礎(chǔ)。在確定了最適溶氧濃度后,rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵最終獲得菌體80 g/L,表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的40%。

    1 材料與方法

    1.1工程菌 工程菌pBVQG8/ MM294由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院構(gòu)建,上海三維生物技術(shù)有限公司保存,受PRPL雙重啟動(dòng)子控制,能在42 ℃下表達(dá)rhG-CSF,具有氨芐抗性。

    1.2培養(yǎng)基 ①種子培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基[4];②基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨 12 g/L、酵母膏 24 g/L、甘油 4 ml/L、KH2PO42.31 g/L、K2HPO412.54 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO40.2 g/L、微量元素[5]3 ml/L;③補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖 500 g/L、MgSO40.2 g/L、100 g/L蛋白胨。

    1.3發(fā)酵方法

    1.3.1種子液制備 取甘油管1支,接種于LB培養(yǎng)基中,在28 ℃ 200 r/min下培養(yǎng)至OD600(波長600 nm處的吸光值)到0.5~0.7之間。再以2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中,在28℃ 200 r/min下培養(yǎng)至OD600到0.5~0.7之間接種于發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。

    1.3.2高密度發(fā)酵 采用分批補(bǔ)料方式[6]。當(dāng)發(fā)酵過程中殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L后,開始補(bǔ)料,控制殘?zhí)菨舛葹? g/L。pH控制為7.0,生長階段溫度控制為28 ℃,誘導(dǎo)溫度控制為42 ℃。

    1.4檢測方法 ①菌體濃度測定:可見光分光光度計(jì)在λ=600 nm處測吸光值。②發(fā)酵液中葡萄糖濃度測定:使用Roche公司生產(chǎn)的血糖儀進(jìn)行檢測。③表達(dá)量的測定:發(fā)酵液菌體做聚丙烯酰胺凝膠電泳,掃描測定rhG-CSF表達(dá)量。④乙酸測定:HPLC法,參照文獻(xiàn)[7]方法。⑤質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測參照文獻(xiàn)[8]方法。

    2 結(jié)果與討論

    2.1溶氧控制失敗與成功的高密度發(fā)酵比較 設(shè)定控制溶氧為30%進(jìn)行發(fā)酵,隨著補(bǔ)料的進(jìn)行,菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后,發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量設(shè)定至最大值,但是DO仍無法控制在30%,DO隨著發(fā)酵的進(jìn)行,不斷下降,直至降為0。生長曲線與溶氧值及乙酸生成情況見圖1,當(dāng)DO降為0后,菌體的OD600值增加速率明顯減緩,甚至不增加,檢測最終發(fā)酵液中的乙酸含量達(dá)到9.2 g/L,已經(jīng)達(dá)到對菌體生長抑制的濃度。這說明溶氧值對大腸桿菌高密度發(fā)酵至關(guān)重要。要解決溶解氧的問題,必須增加純氧供氣,來滿足發(fā)酵過程菌體對氧的需求。

    圖1 溶氧控制失敗的生長情況

    設(shè)定控制溶氧為 30%進(jìn)行發(fā)酵,當(dāng)溶氧控制不住的時(shí)候,改用純氧通氣,使溶氧值始終控制在30%。發(fā)酵結(jié)果:OD600值達(dá)到了75,乙酸最終累積濃度也只有1.23 g/L。

    由圖2可以看出,DO控制成功與否,對于工程菌生長有的顯著的影響。DO控制成功后,發(fā)酵液的OD600可從40左右提高到了75。乙酸積累從原先的9.2 g/L下降到1.23 g/L,未達(dá)到抑制菌體生長的濃度。

    圖2 溶氧控制失敗與成功的菌體生長曲線

    通過上述實(shí)驗(yàn)的比較,說明DO對于rhG-CSF發(fā)酵是至關(guān)重要的,但最適DO還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察進(jìn)行確定。

    2.2溶氧濃度對rhG-CSF工程菌高密度發(fā)酵生長階段的影響 分別控制不同的溶氧濃度(5%~40%),進(jìn)行不誘導(dǎo)高密度發(fā)酵,培養(yǎng)9 h后,取樣,分別測定發(fā)酵液OD600、乙酸含量、質(zhì)粒穩(wěn)定性。

    在DO控制在5%~25%之間時(shí),發(fā)酵最終光密度隨著DO的升高也不斷升高。當(dāng)DO在25%~30%之間時(shí),發(fā)酵液的OD600值也達(dá)到最高值75左右。隨后OD600隨著DO的增加而減少,此種減少可能是由于供氧過高而導(dǎo)致前期菌體快速生長,導(dǎo)致其他的營養(yǎng)物質(zhì)過早耗竭,最終使菌體過早衰老,并發(fā)生菌體自溶所致,見圖3。

    圖3 不同DO值下的菌體密度

    發(fā)酵過程中, 追求高溶氧水平未必能得到高表達(dá)效果。如Meyer和 Fiechter發(fā)現(xiàn), 用枯草桿菌生產(chǎn)A干擾素時(shí), 溶氧限制在較低水平對產(chǎn)物形成有利[9],可能是在高溶氧濃度下,菌體生理代謝活性較強(qiáng), 比生長速率較快, 而質(zhì)粒復(fù)制速度趕不上菌體生長速度, 質(zhì)??截悢?shù)減少, 造成質(zhì)粒穩(wěn)定性降低,質(zhì)粒丟失, 最終影響蛋白產(chǎn)量。所以溶氧對工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響必須進(jìn)行考察,見圖4。隨著DO值的上升,質(zhì)粒穩(wěn)定率也不斷下降,當(dāng)溶氧值大于30%后,質(zhì)粒穩(wěn)定率下降的更加明顯。

    溶氧濃度過低會(huì)弱化TCA循環(huán), 改變轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)基因與葡萄糖和乙酸代謝[10], 導(dǎo)致乙酸大量積累。有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)發(fā)酵液中的乙酸濃度高于5~10 g/L時(shí)[11],會(huì)對菌體生長產(chǎn)生抑制作用, 降低生物量和蛋白產(chǎn)量。因此不同DO下的乙酸積累濃度也必須進(jìn)行考察,結(jié)果見圖5。發(fā)酵液中的乙酸濃度,隨著DO的上升,不斷降低。溶氧值在5%時(shí),乙酸積累濃度高達(dá)7.2 g/L,達(dá)到抑制菌體生長的濃度,當(dāng)DO值超過10%之后,發(fā)酵液中的乙酸積累量都達(dá)不到抑制所需要的濃度。

    圖4 不同DO值下的質(zhì)粒穩(wěn)定性

    圖5 不同DO下的乙酸積累情況

    通過對菌體密度、質(zhì)粒穩(wěn)定性和乙酸積累濃度三方面的考察以及綜合評定,確定了菌體生長階段的最適溶氧濃度為25%。

    2.3不同DO對rhG-CSF表達(dá)的影響 將工程菌種子液接種于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,控制溫度28 ℃,pH 7.0,進(jìn)行高密度發(fā)酵,生長階段DO控制在25%,當(dāng)OD600值到達(dá)30左右時(shí),然后控制不同的溶氧濃度(5%~45%)下,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果見圖6。表達(dá)量隨著所控制的溶氧值升高而升高,當(dāng)DO值到達(dá)35%后,表達(dá)量基本趨于穩(wěn)定,在40%左右??紤]到節(jié)約攪拌動(dòng)力和氧氣用量,筆者決定誘導(dǎo)后溶氧值控制在35%。

    2.4穩(wěn)定性研究 確定好的最適溶氧濃度運(yùn)用于rhG-CSF高密度發(fā)酵中,重復(fù)進(jìn)行3批發(fā)酵,考察其穩(wěn)定性。發(fā)酵條件為溫度28 ℃,溶氧25%、pH7.0,當(dāng)OD600值達(dá)到30左右時(shí),迅速將培養(yǎng)溫度升至42 ℃,同時(shí)控制溶氧濃度為35%。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果見表1,得到基本一致的結(jié)果。

    圖6 不同DO值下的表達(dá)量

    批號誘導(dǎo)OD600最終OD600表達(dá)量(%)菌體量(g/L)F00128.245.840.582F00229.247.141.279F00330.346.538.978

    圖7 3批發(fā)酵菌體電泳圖譜

    2.5結(jié)論 通過在不同溶氧值下工程菌pBVQG8/ MM294高密度發(fā)酵下的菌體生長、質(zhì)粒丟失率、乙酸積累濃度、rhG-CSF表達(dá)量的考察,確定了工程菌生長階段和誘導(dǎo)階段的最適溶氧濃度,分別為25%和35%。通過對溶氧濃度的優(yōu)化,工程菌pBVQG8/ MM294高密度發(fā)酵最終OD600值為45,菌體量為80 g/L,rhG-CSF表達(dá)量為40%。

    [1] 張 力,李龍蕓,林宏英,等,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對腫瘤患者白細(xì)胞的影響[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2001,10(4):207.

    [2] 烏 垠,楊 紅,陸 軍,等,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表達(dá)研究[J].東北師大學(xué)報(bào)2000,32(4):46.

    [3] 李 寅,高海軍,陳 堅(jiān).高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006: 4.

    [4] 盧圣棟,主編.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M],北京:高等教育出版社,1993:590.

    [5] Yee L, Blanch HW. Recombinant trypsin production in high cell density fed-batch cultures in Escherichia coli[J]. Biotechnol Bioeng, 1993, 41(8): 781.

    [6] 俞俊棠,唐孝宣.生物工藝學(xué)[M].上海:華東化工學(xué)院出版社,1994.

    [7] Suare DC, Kilikian BV. Acetic acid accumulation in aerobic growth of recombinant Escherichia coli[J]. Process Biochemistry, 2000, 35: 1051.

    [8] 常海燕,范代娣,駱艷娥. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅱ條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2009, 36(6): 870.

    [9] Meyer HP, Iechter AF. Production of cloned human leukocyt interferon by Bacillus subtilis: Optimal production is connected with rest rained growth[J]. Appl Environ Mi-crobiol, 1985, 50: 503.

    [10] Phue J.N, Shiloach J. Impact of dissolved oxygen concentration on acetate accumulation and physiology of E. coli BL21, evaluating transcription levels of key genes at different dissolved oxygen conditions[J]. Metabolic Engi-neering, 2005, 7: 353.

    [11] Yee L, Blanch HW. Recombinant trypsin production in high cell density fed-batch cultures in Escherichia coli[J]. Biotechnol Bioeng, 1993, 41(8): 781.

    2011-01-22

    [修回日期] 2011-04-22

    EffectofdissolvedoxygenonhighdensityfermentationofE.coliinproducingrhG-CSF

    CEN Yi1, YANG Feng2,TONG Yong1

    (1.Shanghai Sunwaybio Company, Shanghai 201206,China;2.Department of Inorganic Chemistry,School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    ObjectiveTo study the density of the dissolved oxygen(DO) on fermentation of E.coli in producing rhG-CSF.MethodsPure oxygen was used to control DO precisely and to observe the growth of engineered bacteria, the lost of plasmids ,the accumulation of acetic acid from different DO density. The optimum density of DO for fermentation was determined.Results25% in growth phase and 30% after induction was optimum density of DO for rhG-CSF expression and engineered bacteria growth. Under these conditions, the wet cell weight reached(79.6±2.1) g/L and the expression of rhG-CSF was(40.2±1.2)%.ConclusionsThe growth of engineered bacteria and the expression of rhG-CSF were influenced by the density of dissolved oxygen significantly.

    rhG-CSF; high density fermentation; dissolved oxygen

    上海市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目[98-0075(5)].

    岑 仡(1974-),男,執(zhí)業(yè)藥師.共同第一作者:童 涌(1972-),男,碩士,執(zhí)業(yè)藥師.

    楊 峰.Tel: (021)81871220, E-mail: yangfeng1008@sohu.com.

    R966

    A

    1006-0111(2011)03-0197-04

    猜你喜歡
    工程菌溶氧菌體
    石油烴微生物降解基因及其工程菌應(yīng)用研究進(jìn)展
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    7月增氧有學(xué)問,如何在對蝦養(yǎng)殖中后期做好溶氧管理?
    物聯(lián)網(wǎng)監(jiān)控獲得的溶解氧曲線與池塘水質(zhì)指標(biāo)的內(nèi)在關(guān)系
    增氧泵如何合理使用?
    一種發(fā)電機(jī)定子冷卻水低溶氧控制方法探討
    核桃JrLFY基因表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的篩選
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    菌絲霉素NZ2114畢赤酵母工程菌高效發(fā)酵工藝的研究
    廣東飼料(2016年1期)2016-12-01 03:43:01
    在线观看人妻少妇| 精品久久久精品久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产男女超爽视频在线观看| 色94色欧美一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 精品酒店卫生间| 制服丝袜香蕉在线| 国产极品天堂在线| 男人操女人黄网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇人妻 视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩精品网址| 久久久久视频综合| 中国三级夫妇交换| 男女免费视频国产| 1024视频免费在线观看| 国产精品av久久久久免费| 91成人精品电影| 午夜福利乱码中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| a级片在线免费高清观看视频| 久久亚洲国产成人精品v| 黄片小视频在线播放| 久久久欧美国产精品| 久久久精品区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲中文av在线| 18禁国产床啪视频网站| 国产欧美亚洲国产| 人体艺术视频欧美日本| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 99香蕉大伊视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 激情视频va一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影观看| 免费观看无遮挡的男女| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲在久久综合| 青草久久国产| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黄色 视频免费看| 国产探花极品一区二区| 又大又黄又爽视频免费| 久久午夜福利片| 九九爱精品视频在线观看| 黄色配什么色好看| 桃花免费在线播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品久久久av美女十八| 国产福利在线免费观看视频| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品第二区| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av日韩在线播放| 欧美精品国产亚洲| 成人毛片60女人毛片免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲人成电影观看| 日本wwww免费看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产激情久久老熟女| 一级片'在线观看视频| 国产视频首页在线观看| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久热久热在线精品观看| 亚洲伊人色综图| 在线观看一区二区三区激情| 午夜福利一区二区在线看| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区三区综合在线观看| 男女免费视频国产| 亚洲欧洲国产日韩| 搡老乐熟女国产| 久久韩国三级中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲国产看品久久| 大香蕉久久网| 亚洲av欧美aⅴ国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品久久久久久久久免| 国产色婷婷99| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久久久国产电影| 丝袜喷水一区| 欧美激情 高清一区二区三区| 色网站视频免费| 午夜日本视频在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 女人精品久久久久毛片| 成人影院久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产 精品1| 国产乱来视频区| 十八禁高潮呻吟视频| 1024香蕉在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产一区二区三区av在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日本午夜av视频| 亚洲国产av影院在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| av在线老鸭窝| 欧美日本中文国产一区发布| 成人毛片60女人毛片免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 91精品国产国语对白视频| 日本欧美国产在线视频| 亚洲成人一二三区av| 日韩电影二区| 丝袜美腿诱惑在线| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久网色| 美女中出高潮动态图| 亚洲精品aⅴ在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 九九爱精品视频在线观看| 香蕉丝袜av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩视频在线欧美| 国产免费福利视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜激情久久久久久久| 国产1区2区3区精品| 精品久久久精品久久久| 在线观看www视频免费| 亚洲图色成人| 亚洲在久久综合| 国产精品一区二区在线观看99| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产成人精品婷婷| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 少妇的逼水好多| 精品福利永久在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费看av在线观看网站| 免费看不卡的av| 久久人妻熟女aⅴ| 大香蕉久久网| 国产成人欧美| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品第二区| 成人手机av| 伊人久久国产一区二区| 伊人久久国产一区二区| 美女中出高潮动态图| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久这里有精品视频免费| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看三级黄色| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 成人影院久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美最新免费一区二区三区| 99热网站在线观看| 咕卡用的链子| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产午夜精品一二区理论片| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲内射少妇av| www日本在线高清视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧洲国产日韩| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久精品免费免费高清| 国产av码专区亚洲av| 欧美日韩精品成人综合77777| 日日爽夜夜爽网站| 国产在线一区二区三区精| 在线天堂最新版资源| 女人精品久久久久毛片| 高清欧美精品videossex| 男人舔女人的私密视频| 国产精品一区二区在线观看99| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久人妻| 亚洲av电影在线进入| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美日韩av久久| 宅男免费午夜| 五月伊人婷婷丁香| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产野战对白在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 街头女战士在线观看网站| 色视频在线一区二区三区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产男女内射视频| 国产日韩欧美视频二区| 黄片小视频在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 国产男女内射视频| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩综合久久久久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 99九九在线精品视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久鲁丝午夜福利片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 国产av精品麻豆| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 777米奇影视久久| 美女国产高潮福利片在线看| 两个人免费观看高清视频| 久久久久久久久久久免费av| 少妇精品久久久久久久| 免费观看av网站的网址| 多毛熟女@视频| 少妇熟女欧美另类| 国产毛片在线视频| 69精品国产乱码久久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 女人精品久久久久毛片| 午夜91福利影院| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产av一区二区精品久久| 精品酒店卫生间| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久久久人人人人人人| 日本色播在线视频| 天堂8中文在线网| 一区二区三区乱码不卡18| 久久狼人影院| 街头女战士在线观看网站| 9191精品国产免费久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 最新的欧美精品一区二区| 99久久综合免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品无大码| av国产精品久久久久影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 天天操日日干夜夜撸| 黄色怎么调成土黄色| 新久久久久国产一级毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美中文综合在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 日韩视频在线欧美| 中文天堂在线官网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久 成人 亚洲| 91成人精品电影| 美女大奶头黄色视频| 色播在线永久视频| 久久久国产精品麻豆| 午夜福利在线免费观看网站| 精品第一国产精品| 午夜福利一区二区在线看| 各种免费的搞黄视频| 久久久久久久国产电影| 最黄视频免费看| 三级国产精品片| 伊人亚洲综合成人网| 欧美人与性动交α欧美软件| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产又色又爽无遮挡免| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 男女下面插进去视频免费观看| 777米奇影视久久| 99久国产av精品国产电影| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕制服av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久影院123| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品,欧美精品| www日本在线高清视频| 大香蕉久久网| 免费av中文字幕在线| 日本91视频免费播放| 一区二区三区精品91| 亚洲情色 制服丝袜| 91成人精品电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 高清av免费在线| 18禁观看日本| 国产在线免费精品| 日韩av免费高清视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产毛片在线视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品乱久久久久久| 超碰成人久久| 美女午夜性视频免费| 精品国产乱码久久久久久男人| www.熟女人妻精品国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 永久免费av网站大全| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产日韩欧美在线精品| 两性夫妻黄色片| 在现免费观看毛片| 日本免费在线观看一区| 超碰成人久久| 国产熟女欧美一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 伦精品一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 97在线人人人人妻| 黑丝袜美女国产一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲人成网站在线观看播放| 18在线观看网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 飞空精品影院首页| 午夜福利在线免费观看网站| 有码 亚洲区| 国产精品一二三区在线看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲国产av影院在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费看av在线观看网站| 女性生殖器流出的白浆| 各种免费的搞黄视频| 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久99热这里只频精品6学生| 国产免费又黄又爽又色| 欧美日韩一级在线毛片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 亚洲国产精品一区三区| 捣出白浆h1v1| 亚洲成人手机| 中文字幕人妻丝袜制服| 老司机影院成人| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲久久久国产精品| 一级毛片 在线播放| 欧美日韩av久久| kizo精华| 免费观看av网站的网址| 在线观看国产h片| 91成人精品电影| 国产熟女午夜一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱| av网站在线播放免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 丝瓜视频免费看黄片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕制服av| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品亚洲成a人片在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 丝袜喷水一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 黄频高清免费视频| 成人国语在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美最新免费一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| 蜜桃在线观看..| 亚洲人成电影观看| 美女福利国产在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 激情五月婷婷亚洲| 97人妻天天添夜夜摸| 考比视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 91精品三级在线观看| 有码 亚洲区| 男女午夜视频在线观看| 18禁观看日本| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 看免费av毛片| 免费看不卡的av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 自线自在国产av| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产av码专区亚洲av| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 满18在线观看网站| 亚洲三区欧美一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 有码 亚洲区| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久 成人 亚洲| 香蕉丝袜av| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 高清在线视频一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久a久久爽久久v久久| 大片电影免费在线观看免费| h视频一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 波野结衣二区三区在线| 9热在线视频观看99| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 波野结衣二区三区在线| 永久网站在线| 午夜av观看不卡| 一级a爱视频在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 午夜免费鲁丝| 蜜桃在线观看..| 成人影院久久| kizo精华| 久久热在线av| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 又大又黄又爽视频免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久国产精品大桥未久av| 久久精品国产综合久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 黄色毛片三级朝国网站| 人妻一区二区av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕色久视频| 三上悠亚av全集在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩一区二区三区影片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线观看人妻少妇| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 一区在线观看完整版| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 大香蕉久久网| 9色porny在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 尾随美女入室| 激情五月婷婷亚洲| 蜜桃在线观看..| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲人成77777在线视频| xxxhd国产人妻xxx| 婷婷色av中文字幕| 999精品在线视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲综合精品二区| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 欧美在线黄色| 日韩av免费高清视频| 天天影视国产精品| 亚洲av福利一区| 国产又爽黄色视频| 2018国产大陆天天弄谢| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧洲日产国产| 日本黄色日本黄色录像| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久免费观看电影| 亚洲图色成人| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美最新免费一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜免费观看性视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丰满饥渴人妻一区二区三| 美女国产视频在线观看| 尾随美女入室| 人妻人人澡人人爽人人| 街头女战士在线观看网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久热在线av| 香蕉丝袜av| 另类精品久久| 亚洲综合色网址| 亚洲久久久国产精品| 99久国产av精品国产电影| 青草久久国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 少妇熟女欧美另类| 色吧在线观看| 午夜福利,免费看| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久国产欧美日韩av| 天美传媒精品一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 蜜桃国产av成人99| 精品午夜福利在线看| 久久鲁丝午夜福利片| 下体分泌物呈黄色| 视频区图区小说| 午夜福利一区二区在线看| 男男h啪啪无遮挡| 午夜日本视频在线| 老女人水多毛片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费观看av网站的网址| 成人二区视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲成色77777| 97精品久久久久久久久久精品| av片东京热男人的天堂| kizo精华| 99久国产av精品国产电影| 欧美日韩一级在线毛片| 秋霞伦理黄片| 色播在线永久视频| 久久99蜜桃精品久久| 精品亚洲成国产av| 久久久久久久精品精品| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产视频首页在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人二区视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产成人精品在线电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 精品一区二区免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 国产片特级美女逼逼视频| 又大又黄又爽视频免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 五月天丁香电影| 又大又黄又爽视频免费| 18禁国产床啪视频网站| www日本在线高清视频| 欧美bdsm另类| 国产精品不卡视频一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲欧美成人精品一区二区| av电影中文网址| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产在视频线精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产精品亚洲av一区麻豆 | 午夜av观看不卡| 国产av一区二区精品久久| 精品久久久精品久久久| 日韩中字成人|