中藥復(fù)方二神丸主要化學(xué)成分的高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

紀(jì)松崗，吳海棠，苗華艷，吳 思，李 祥

(1.解放軍第401醫(yī)院藥劑科,山東 青島 266071;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.解放軍62370部隊(duì),北京 100071；4.解放軍62380部隊(duì)，北京 100071)

中藥復(fù)方二神丸主要化學(xué)成分的高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

紀(jì)松崗1，吳海棠2，苗華艷3，吳 思2，李 祥4

(1.解放軍第401醫(yī)院藥劑科,山東 青島 266071;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.解放軍62370部隊(duì),北京 100071；4.解放軍62380部隊(duì)，北京 100071)

目的通過(guò)高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù),對(duì)中藥復(fù)方二神丸中的主要化學(xué)成分進(jìn)行有效的鑒定。方法色譜分離采用資生堂 Capcell Pak C18反相柱(3.0 mm×100 mm, 3 μm)，流動(dòng)相組成分別為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，流速為0.6 ml/min；質(zhì)譜定性采用飛行時(shí)間質(zhì)譜，正離子模式掃描。結(jié)果在優(yōu)化的液質(zhì)聯(lián)用條件下，通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出二神丸中21個(gè)成分，其中15種成分來(lái)自補(bǔ)骨脂,6種成分來(lái)自肉豆蔻。結(jié)論通過(guò)RRLC-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，為鑒定二神丸中的化學(xué)成分建立起了一種快速、高效的分析方法。

二神丸；高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜；化學(xué)成分

二神丸出自宋·許叔微的《普濟(jì)本事方》,由補(bǔ)骨脂和肉豆蔻組成，為臨床常用方劑,功可溫腎暖脾,澀腸止瀉[1]。明代薛己《內(nèi)科摘要》對(duì)二神丸也有所記載，并將二神丸與五味子散兩方合為四神丸，為治療腎泄的名方[2]。李冀等[3, 4]以二神丸、四神丸對(duì)脾虛泄瀉治療作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，唐昌娟等[2]以四神丸除去五味子散后的藥物組方配比加水煎煮后得到二神湯，并對(duì)其進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。但目前尚未見(jiàn)到有關(guān)二神丸主要化學(xué)成分分析的報(bào)道。而中藥復(fù)方中多成分的鑒定分析是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分之一，對(duì)闡明中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開(kāi)發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義。傳統(tǒng)分析方法通常需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分離和提取過(guò)程而得到單一化學(xué)成分,繼而通過(guò)核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)等其它分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且只對(duì)某一類(lèi)化合物鑒定，難以完整、系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥復(fù)方中多類(lèi)成分的復(fù)雜性[5]。而高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜作為新起且發(fā)展迅速的質(zhì)譜技術(shù)，具有檢測(cè)靈敏度高，測(cè)定化合物質(zhì)荷比精確，離子掃描范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可與液相色譜聯(lián)用，現(xiàn)已越來(lái)越多的用于中藥分析中[6, 7]。

本研究采用HPLC-TOF/MS技術(shù)對(duì)二神丸中多成分進(jìn)行鑒別，該法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為二神丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

1 儀器和試藥

安捷倫1200型液相色譜儀，包括在線(xiàn)脫氣機(jī)，二元泵，高性能自動(dòng)進(jìn)樣器；安捷倫G6220A飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)，MassHunter色譜工作站和Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)。

補(bǔ)骨脂、肉豆蔻藥材購(gòu)自上海雷允上北區(qū)中達(dá)大藥房，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所。

HPLC級(jí)乙腈(Merck，Germany)；HPLC級(jí)甲酸(Tedia，USA)；無(wú)水乙醇為分析醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 試驗(yàn)

2.1色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Capcell Pak C18(3.0 mm×100 mm, 3 μm)，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液A，乙腈B；梯度洗脫：0～10 min(0%B～25%B)，10～45 min(25%B～75%B), 45～50 min(75%B)；柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μl，流速0.6 ml/min。

2.1.2質(zhì)譜條件 電噴霧正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 110～1 000；毛細(xì)管電壓4 000 V; 霧化氣壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碎片電壓160 V。選擇參比校準(zhǔn)液做實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Qualitative Analysis軟件處理。測(cè)定樣品之前，使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差小于2 ppm。

2.2供試品溶液制備 按二神丸處方比例稱(chēng)取補(bǔ)骨脂1.0 g、肉豆蔻0.5 g，加入80%乙醇30 ml，超聲30 min，取5 ml醇提液，10 800 r/min離心5 min，取上清在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析。

2.3二神丸中化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立 根據(jù)二神丸各組方藥材的化學(xué)成分研究報(bào)道，收集了補(bǔ)骨脂化學(xué)成分68個(gè)，肉豆蔻化學(xué)成分49個(gè)，并通過(guò)安捷倫“formula-database-generator”軟件建立二神丸各組方藥材中已知化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫(kù)。

3 結(jié)果與討論

3.1實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 首先考察了甲醇-水和乙腈-水2種體系，結(jié)果顯示乙腈的洗脫效果要優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈作為有機(jī)相。在流動(dòng)相體系中加入甲酸可增加質(zhì)譜響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)考察了甲酸的添加量對(duì)分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸濃度在0.1%時(shí)大多數(shù)成分有不錯(cuò)的質(zhì)譜響應(yīng)。因此，最終采用0.1%甲酸水溶液作為水相。

質(zhì)譜檢測(cè)分別比較了正、負(fù)離子2種掃描模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正模式下峰容量更大、質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，故實(shí)驗(yàn)最終選擇在正模式下進(jìn)行。

3.2二神丸中主要化學(xué)成分的鑒別 在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，二神丸提取液的HPLC-TOF/MS典型總離子流圖見(jiàn)圖1。筆者對(duì)其中主要的21個(gè)峰進(jìn)行了鑒別，其中包括4對(duì)同分異構(gòu)體。其中，峰1和2這一對(duì)同分異構(gòu)體，兩者質(zhì)譜裂解所得碎片離子相同，故通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，判定峰1為補(bǔ)骨脂素，峰2為異補(bǔ)骨脂素。其它化合物按照以下方法鑒別：首先，根據(jù)TOF/MS上所得到的精確化合物分子量信息，通過(guò)MassHunter軟件在5 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計(jì)算其可能的元素組成，并將其與所建的數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，對(duì)二神丸化學(xué)成分的初步鑒別，結(jié)果見(jiàn)表1。然后對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別，調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，區(qū)分各同分異構(gòu)體，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 二神丸提取物TOF/MS總離子流圖

圖2 psoralenol和corylifol C ESI-MS裂解途徑

序號(hào)時(shí)間(min)鑒定結(jié)果分子式[M+H]+m/z測(cè)量值理論值偏差(ppm)[M+Na]+m/z11)7．441psoralenC11H6O3187．0393187．0395-1．93209．029221)7．905IsopsoralenC11H6O3187．0397187．0395-3．91209．029831)7．943coumestrolC15H8O5269．0449269．0444-1．63290．994741)8．336psoralenolC20H18O5339．1226339．12270．24361．112851)10．932corylifolCC20H18O5339．1233339．1227-1．8361．112061)12．553corylifolBC20H20O5341．1388341．1384-1．38363．128772)12．716elemicinC12H16O3209．1168209．11721．94231．103681)13．468neobavaisoflavoneC20H18O4323．1278323．12831．5345．117092)14．123myristicinC11H12O3193．0852193．08593．6215．1693101)14．410bavachinC20H20O4325．1429325．14341．65347．1330112)14．9225′?methoxydehydrodiisoeugenolC21H24O5357．1689357．17023．63379．2152122)15．021myrisisolignanC21H26O6375．1816375．1808-2．13397．1716131)15．929corylinC20H16O4321．1129321．1121-2．47343．1031141)16．520bavachromeneC20H18O4323．1284323．1283-0．3345．11178151)17．687CorylifolDC20H16O5337．1075337．1071-1．25359．0973162)19．7654?allyl-2?methoxyphenolC10H12O2165．0905165．0913．35187．0799171)20．932isobavachalconeC20H20O4325．1426325．14342．49347．1332182)21．928licarinAC20H22O4327．1577327．15914．28349．1470191)23．713corylifolAC25H26O4391．1895391．19042．35413．1793201)28．253bavachalconeC21H22O4339．1600339．1519-2．77361．1418211)33．816bakuchiolC18H24O257．1892257．19053．19279．1499

注：1)補(bǔ)骨脂中的成分，2)肉豆蔻中的成分。

以分子離子峰339為例，來(lái)說(shuō)明鑒別過(guò)程。在碎片電壓160 V條件下，峰4、峰5和峰20的分子離子峰均為339。但由于TOF精確分子量的特點(diǎn)，在此我們可以將峰20的分子離子峰339.160 0與峰4和峰5的分子離子峰339.122 6、339.122 7區(qū)分開(kāi)來(lái)。峰20的元素組成為C21H22O4，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，可判定其為bavachalcone(補(bǔ)骨脂查耳酮)；峰4和峰5的元素組成均為C20H18O5，為一對(duì)同分異構(gòu)體，psoralenol(補(bǔ)骨脂異黃酮醇)和corylifol C。為進(jìn)一步區(qū)分這對(duì)同分異構(gòu)體，調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，得到此電壓條件下的質(zhì)譜圖。峰4的質(zhì)譜圖上有明顯的321.113 7[M-H2O]+, 293.100 1[M-H2O-CO]+，279.068 1[M-H2O-CO-CH2]+, 267.066 6[M-C4H8O]+，239.072 0[M-C4H8O-CO]+等碎片離子信息，推斷出裂解途徑見(jiàn)圖2(a)所示。峰5的質(zhì)譜圖上有明顯的283.062 6[M-C4H8]+，255.066 6[M-C4H8-CO]+，237.058 1[M-C4H8-CO-H2O]+，227.074 3[M-C4H8-CO-CO]+，297.082 5[M-C3H6]+等碎片信息，推斷出裂解途徑見(jiàn)圖2(b)所示。結(jié)合以上信息，筆者能夠鑒定峰4為psoralenol(補(bǔ)骨脂異黃酮醇)，峰5為corylifol C。采用類(lèi)似的方法，能夠?qū)ζ渌逡策M(jìn)行相應(yīng)的鑒別。

表2 二神丸化學(xué)成分中同分異構(gòu)體的鑒別結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用RRLC-TOF/MS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)二神丸中主要成分的快速定性分析?？偣茶b定出21個(gè)活性成分，其中15種成分來(lái)自補(bǔ)骨脂,6種成分來(lái)自肉豆蔻。該技術(shù)為中藥復(fù)方多成分分析提供了一種有效、可靠的方法，也同樣適用于其它復(fù)雜體系的分析。

[1] 王 縉,付慶會(huì). 宋明期間二神丸和五味子散兩方的發(fā)展演變[J]. 四川中醫(yī),2010,28:115.

[2] 唐昌娟, 施 貝, 修彥鳳,等. 二神湯中補(bǔ)骨脂素_異補(bǔ)骨脂素的藥動(dòng)學(xué)研究[J]. 上海中醫(yī)藥雜志,2011,45:72.

[3] 李 冀, 鄒大威, 杜雅薇,等. 二神丸與四神丸對(duì)脾虛泄瀉大鼠分泌型IgA白介素-2含量影響的配伍比較研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25:2437.

[4] 李 冀, 鄒大威, 杜雅薇,等. 二神丸與四神丸對(duì)脾虛泄瀉作用的配伍比較研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2007,34:728.

[5] Zhan ZJ, Fan CQ, Ding J,etal. Novel diterpenoids with potent inhibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activities from a well-known TCM plantDaphnegenkwa[J]. Bioorg Med Chem,2005,13:645.

[6] Zhu Z, Zhang H, Zhao L,etal. Rapid separation and identification of phenolic and diterpenoid constituents fromRadixSalviamiltiorrhizae by high-performance liquid chromatography diode-array detection, electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry and electrospray ionization quadrupole ion trap mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom,2007,21:1855.

[7] Zhao L, Lou ZY, Zhu ZY,etal. Characterization of constituents inStellerachamaejasmeL. by rapid-resolution liquid chromatography-diode array detection and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr,2008,22:64.

2011-01-18

[修回日期] 2011-10-21

AnalysisonchemicalconstituentsofershenpillbyHPLC-TOF/MS

JI Song-gang1, WU Hai-tang2, MIAO Hua-yan3, WU Si2, LI Xiang2

(1.Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingdao 266071，China; 2. School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China; 3.No.62370 PLA troop, Beijing 100071，China; 4. No. 62380 PLA troop, Beijing 100071，China)

ObjectiveTo analyze chemical constituents of ershen pill by rapid-resolution(high performance) liquid chromatography-time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF/MS).MethodsA shelloseido column(3.0 mm×100 mm，3 μm) was used to separate. The mobile phase consisted of water containing 0.1% methane acid and acetonitrile was used as gradient elute. The flow rate was 0.6 ml/min. TOF/MS was applied for qualitative analysis under positive ion mode.ResultsUnder LC/MS condition, 21 major constituents in ershen pill were identified by time of flight mass spectrometry, among which, 15 constituents were from Psoralea corylifolia L,and 6 constituents were fromMyristicafragransHoutt.ConclusionA simple and reliable method using HPLC-TOF/MS was established to identify the chemical constituents of ershen pill.

ershen pill; HPLC-TOF/MS; chemica1 constituents

紀(jì)松崗(1964-)，男，博士，主任藥師.E-mail:shanshan054340@163.com.

R917

A

1006-0111(2011)06-0435-03