LC-MS-MS法測(cè)定人血漿中阿托伐他汀濃度

姜 楠，楊永革，許雪廷，趙鋼濤

(北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京100700)

·論著·

LC-MS-MS法測(cè)定人血漿中阿托伐他汀濃度

姜 楠，楊永革，許雪廷，趙鋼濤

(北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京100700)

目的建立液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC-MS-MS)測(cè)定人血漿中阿托伐他汀(atorvastatin )濃度。方法采用萃取法處理血漿樣品進(jìn)行LC-MS-MS分析。分析柱為美國(guó)Thermo公司Thermo BioBasic-C8柱(2.1 mm×100 mm，5 μm) ；流動(dòng)相為乙腈(含0.1%甲酸):水(含0.1%甲酸)=70:30；流速0.3 ml/min；質(zhì)譜條件：電噴霧離子化電離源ESI負(fù)離子檢測(cè)，噴霧電壓(SP)3 500 KV，鞘氣(SGP)流速10 Arb，輔助氣(AGP)流速15 Arb，毛細(xì)管溫度(TEM)314 ℃；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)分別測(cè)定阿托伐他汀和甲苯磺丁脲 558→278 m/z(30 EV)和269→106 m/z(22 EV) 。結(jié)果阿托伐他汀在0.1～20 μg/L檢測(cè)濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r>0.99)，最低定量限(LLOQ)為0.1 μg/L，絕對(duì)回收率在70%以上，高中低3種濃度的日內(nèi)和日間RSD≤15%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于臨床阿托伐他汀的血藥濃度監(jiān)測(cè)及I期臨床試驗(yàn)。

阿托伐他汀鈣；血藥濃度；液質(zhì)聯(lián)用色譜法

阿托伐他汀鈣為3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑[1]，主要通過抑制HMG-CoA還原酶的合成，從而抑制體內(nèi)膽固醇的合成，由于細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的減少，刺激細(xì)胞合成低密度脂蛋白(LDL)受體加速，使肝臟表面LDL受體數(shù)目增多及活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)和VLDL殘粒通過受體降解途徑代謝，降低血清LDL含量。此外，由于本品抑制了細(xì)胞合成膽固醇，干擾了脂蛋白的生成，使血清總膽固醇水平下降，血清甘油三酯水平也有一定程度的降低[2]。其適應(yīng)證為：①原發(fā)性高膽固醇血癥和混合型高脂血癥。②高膽固醇血癥并有動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)的病人。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖。

1 儀器與材料

1.1儀器 質(zhì)譜儀：Thermo Finnigan TSQ Quantum型液相色譜——三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源(ESI源)；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)：G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器；G1312A二元梯度泵；在線脫氣機(jī)、柱溫箱(美國(guó)Agilent公司)；Finnigan Xcalibur 色譜/質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)。Sigma1-14型高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)；Sartorius BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2材料 阿托伐他汀鈣對(duì)照品(純度95.3%，批號(hào)100590-200501，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲苯磺丁脲對(duì)照品 (純度100.0%，批號(hào)100500-200801，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。乙腈、乙酸乙酯(Fisher公司)為進(jìn)口色譜純級(jí)；甲酸、碳酸鈉等試劑均為分析純級(jí)；分析用水為娃哈哈集團(tuán)生產(chǎn)的蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為美國(guó)Thermo公司Thermo BioBasic-C8柱(2.1 mm×100 mm，5 μm) ；流動(dòng)相為乙腈(含0.1%甲酸):水(含0.1%甲酸)=70:30；流速0.3 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；柱溫為室溫。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用氣動(dòng)輔助電噴霧離子化電離源(ESI)，負(fù)離子方式檢測(cè)；噴霧電壓(SP)3 500 V；加熱毛細(xì)管溫度(TEM)314 ℃；鞘氣(SGP)流速10 Arb；輔助氣(AGP)流速15 Arb；碰撞氣(CID)壓力1.5 mTorr；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離(Source CID)能量為10 V；質(zhì)譜掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，分別測(cè)定阿托伐他汀和甲苯磺丁脲反應(yīng)離子m/z 558→278(30 EV)和m/z 269→106(22 EV)；掃描時(shí)間為0.2 s。

2.2血漿樣本的預(yù)處理 精密量取血漿樣品0.5 ml，置于10 ml具塞玻璃離心管中，加100 μl內(nèi)標(biāo)(甲苯磺丁脲乙腈溶液，1 mg/L)，混勻，再加100 μl 0.1 M的碳酸鈉水溶液混勻，超聲2 min，加3 ml乙酸乙酯，在微型混合器上渦流振蕩2 min，離心(2 000 r/min)5 min分層，取上清液轉(zhuǎn)移至另一10 ml玻璃離心管中，37 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑?20 μl流動(dòng)相復(fù)溶，在微型混合器上渦流振蕩1 min，離心(10 000 r/min)10 min，取上清液10 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 ①阿托伐他汀工作溶液：精確稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品10.87 mg(相當(dāng)于阿托伐他汀10 mg)，用乙腈配制成濃度為1 g/L的工作溶液，-70 ℃保存待用，1個(gè)月后重新配制。②甲苯磺丁脲工作溶液(內(nèi)標(biāo))：精確稱取一定量甲苯磺丁脲，用乙腈配制成濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存待用，一個(gè)月后重新配制。

用阿托伐他汀鈣對(duì)照品配成一系列濃度的工作溶液，分別取各濃度工作溶液10 μl于0.5 ml空白血漿中，使阿托伐他汀的血漿終濃度分別為0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，20 μg/L，余同血漿樣品的處理與測(cè)定。

2.4線性范圍與定量限 將不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的阿托伐他汀與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，阿托伐他汀濃度為橫坐標(biāo)，直線加權(quán)回歸。結(jié)果表明血漿中阿托伐他汀濃度在0.1～20 μg/L范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系Y=0.072 827 5+0.121 806X(r2=0.992 7)。試驗(yàn)期間制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2值均在0.99以上。方法的最低檢測(cè)濃度為0.1 μg/L，其RSD值為10.9%。

2.5特異性考察 按選定的LC/MS/MS條件測(cè)得6名健康人的空白血漿；空白血漿+ 阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)樣品+內(nèi)標(biāo)；受試者口服阿托伐他汀鈣片后的血漿樣品質(zhì)量色譜圖，見圖1。阿托伐他汀與甲苯磺丁脲分別在1.40和1.32 min出峰，由圖可見血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

圖1 血漿中阿托伐他汀SRM色譜圖

2.6精密度與回收率 按阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備質(zhì)控樣品，對(duì)0.25，2.5和10 μg/L 3種濃度進(jìn)行了連續(xù)3 d的6份樣本分析，以評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)、日間精密度。同時(shí)以流動(dòng)相代替空白血漿，同樣方法配制高、中、低3種濃度(0.25、2.5、10 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，計(jì)算回收率。低、中、高3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度分別為0.248±0.053、2.483±0.202、9.975±0.741μg/L；日內(nèi)精密度分別為11.10、8.08、2.90%；日間精密度分別為7.30、8.50、7.76%；提取回收率分別為(79.16±7.90)%、(78.07±4.78)%、(72.28±4.53)%。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 將阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的 (0.25、2.5、10 μg/L) 的血漿樣品，按以下操作進(jìn)行穩(wěn)定性考察：血漿樣品室溫放置2 h的穩(wěn)定性；血漿樣品處理后放置8 h的穩(wěn)定性；室溫與-70 ℃交替凍融3次的穩(wěn)定性；-70 ℃保存30 d的穩(wěn)定性。每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定6份樣品與放置0 h的樣本進(jìn)行比較，計(jì)算后各濃度變異均小于15%，穩(wěn)定性符合指導(dǎo)原則。

3 討論

試驗(yàn)初期，我們考察了酸化或堿化加液-液萃取的方法，提取出的目標(biāo)化合物濃度較低，最低檢測(cè)限僅為0.5 μg/L。后發(fā)現(xiàn)加入超聲方法可以提高提取效率，并且堿性條件下的超聲效果優(yōu)于在酸性條件下超聲，最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.1 μg/L。這也許是堿性條件下超聲不利于阿托伐他汀與血漿蛋白結(jié)合，使得游離藥物濃度增多所致。本方法還考察了甲基叔丁基醚[3]、乙酸乙酯[4]、正己烷、乙醚等有機(jī)溶劑對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果證明醚類試劑提取的空白血漿中的雜質(zhì)干擾更大一些，因此選擇低毒、低成本的乙酸乙酯作為萃取劑。本方法靈敏、準(zhǔn)確，可作為阿托伐他汀I期臨床研究的試驗(yàn)方法

[1] Plosker GL, Wagstaff AJ. Fluvastatin: a review of its pharmacology and use in the management og hypercholesterolaemia[J]. Drμgs, 1996, 51: 433.

[2] Naoumova RP, Marais AD, Mountney J,etal. Plasma mevalonic acid, an index of cholesterol synthesis in vivo and responsiveness to HMG-CoA reductase inhibitors in familial hypercholesterolaemia[J]. Atherosclerosis, 1996, 119: 203.

[3] 胡曉玲，李環(huán)德. UPLC-MS/MS法測(cè)定健康人血漿中的阿托伐他汀濃度及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究[J].中南藥學(xué)，2008，6(4)：400.

[4] 董 婧, 陳西敬, 宋 捷, 等. 阿托伐他汀大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及腸肝循環(huán)研究[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(1)：55.

2010-05-18

[修回日期] 2010-09-09

DeterminationofAtorvastatininhumanplasmabyLC-MS-MS

Jiang Nan，Yang Yong-Ge，Xu Xue-Ting，Zhao Gang-Tao

(Department of Pharmacy，General Hospital of Beijing Military Command of PLA，Beijing 100700，China)

ObjectiveTo establish a method for determining Atorvastatin in human plasma by LC-MS-MS.MethodsAtorvastatin was extracted for determination by LC-MS-MS. Analytical column was Thermo BioBasic-C8(2.1 mm×100 mm，5 μm). The mobile phase was acetonitrile(0.1%acid):water(0.1%acid)=70:30. Mass spectrum conditions was ESI performing in the SRM mode using target ions m/z 558→278(30EV)(Atorvastatin ), m/z 269→106(22 EV)(tolbutamide), SP 3 500 KV, SGP 10 Arb, AGP 15 Arb, TEM 314 ℃.ResultsThe calibration curve was linear over the range of 0.1～20 μg/L. The LLOQ of Atorvastatin in plasma was 0.1 μg/L. The extracted recovery was>70%. The intra-and inter-dayRSDwere<15%.ConclusionThe method is sensitive, simple and accurate to determinate Atorvastatin plasma concentration and suitable to study phase I clinical test of Atorvastatin.

Atorvastatin; plasma concentration; LC-MS-MS

姜 楠(1977-)，女，碩士，主管藥師.Tel:(010)66721899,E-mail:jiangnan7757@163.com.

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1006-0111(2011)01-0015-03