原子力顯微鏡表征燕麥β－葡聚糖的分子鏈形態(tài)

吳 佳 鄧 霄 謝筆鈞

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院1，福州 350108)

(福建東南標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證中心2，福州 350002)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院3，武漢 430070)

原子力顯微鏡表征燕麥β－葡聚糖的分子鏈形態(tài)

吳 佳1鄧 霄2謝筆鈞3

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院1，福州 350108)

(福建東南標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證中心2，福州 350002)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院3，武漢 430070)

利用原子力顯微鏡(AFM)研究了不同濃度和存放時間對燕麥β－葡聚糖分子聚集狀態(tài)的影響?？疾炝薙DS、Tween－20和Tween－80三種表面活性劑對聚集體的分散效果。利用粒度分析儀測定了不同濃度β－葡聚糖在溶液中的聚集體尺寸，并和AFM的結(jié)果進行了比較。結(jié)果顯示，聚集體的尺寸隨著β－葡聚糖濃度的升高而增大，若將低濃度的β－葡聚糖溶液放置一定時間，其中也可以形成聚集體。表面活性劑SDS能夠分散1 μg/mL的β－葡聚糖溶液中的聚集體，得到單個β－葡聚糖分子，通過AFM直接觀察了單個糖鏈的形態(tài)。粒度分析儀和AFM測定的聚集體尺寸有一定差異，可能與AFM的制樣方法有關(guān)。

燕麥 β－葡聚糖 原子力顯微鏡 分子鏈形態(tài)

燕麥β－葡聚糖是存在于燕麥亞糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中的一種線型多糖，由β－(1→3)和β－(1→4)糖苷鍵連接的葡萄糖單位構(gòu)成［1］。因其具有降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等活性而受到廣泛的關(guān)注［2］。大量的研究表明，燕麥β－葡聚糖的生理作用與其在水溶液中的形態(tài)和構(gòu)象密切相關(guān)，因而通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄑ芯喀拢暇厶窃谒芤褐械姆肿訝顟B(tài)和聚集行為將有助于對其諸多生理功能的理解。

多糖在溶液中往往可以形成聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。光散射和黏度研究表明，啤酒中的β－葡聚糖可以形成纓狀膠束聚集體［3］。對燕麥β－葡聚糖溶液的黏彈性行為研究證實了低分子質(zhì)量的β－葡聚糖更容易形成凝膠，并推測β－葡聚糖分子之間產(chǎn)生了物理交聯(lián)作用［4］。大麥β－葡聚糖的流變學(xué)行為則揭示了多糖分子之間是如何在特定的溶液環(huán)境中形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的［5］。對多糖溶液進行適當(dāng)?shù)奶幚?，可以得到多糖分子的單鏈，這些單分子鏈可以利用電子顯微鏡和其他顯微鏡技術(shù)進行直接觀察和形態(tài)分析。

原子力顯微鏡(AFM)是一種研究多糖分子在溶液中的形態(tài)和構(gòu)象的直觀方法，已經(jīng)成功應(yīng)用于結(jié)冷膠、海藻酸鹽、果膠、裂褶多糖和淀粉的研究［6］。但是目前利用AFM研究燕麥β－葡聚糖的工作還非常少。鑒于樣品的制備方法對AFM的觀察結(jié)果具有決定性的影響，因而需要仔細(xì)選擇合適的制樣方法和步驟，以得到多糖在不同溶液環(huán)境下的真實狀態(tài)。例如，為了得到單個的多糖分子，有時需要使用表面活性劑進行分散處理。得到了多糖樣品的AFM圖像之后，可以從中分析出多糖鏈的輪廓長度、末端距和持續(xù)長度等參數(shù)，并可以進一步推斷出已知結(jié)構(gòu)線型多糖的分子質(zhì)量和多分散系數(shù)等統(tǒng)計學(xué)參數(shù)。而AFM得到的單分子形貌是其他儀器分析方法所無法獲得的，具有獨特的價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

燕麥β－葡聚糖:從燕麥粉中提取，經(jīng)純化后β－葡聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.8%，相對分子質(zhì)量4.49×105;十二烷基磺酸鈉(SDS):Sigma公司;Tween－20、Tween－80:上海化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器

原子力顯微鏡:AJ－Ⅲ，上海愛建納米科技發(fā)展有限公司;恒溫加熱磁力攪拌器:MR 2002，德國Heidolph公司;粒度分析儀:N4 plus，美國Beckman Coulter公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 用于聚集態(tài)觀察的樣品制備

將燕麥β－葡聚糖溶于適量去離子水中，80℃攪拌溶解1 h使其充分溶解成為澄清透明的溶液，定容，制得1 mg/mL的β－葡聚糖溶液。然后將溶液逐步稀釋成為 100、50、20、10、1 μg/mL。按上述方法新鮮制備的溶液即可用于AFM觀察。

取不同濃度的燕麥β－葡聚糖樣品滴加到云母片表面觀察其濃度效應(yīng)產(chǎn)生的不同聚集狀態(tài)。將新鮮制備的β－葡聚糖溶液于室溫存放9 d后再次觀察時間效應(yīng)導(dǎo)致其在溶液中產(chǎn)生的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 用于單鏈觀察的樣品制備

分別將SDS、Tween－20和Tween－80加入β－葡聚糖溶液中，使SDS、Tween－20和 Tween－80的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，β－葡聚糖的最終質(zhì)量濃度也為1 mg/mL，并加熱溶解，然后用80℃的去離子水將混合溶液逐步稀釋成最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的溶液，最后將約1 μL的溶液滴加至云母片表面并于干燥器中自然干燥。

1.3.3 原子力顯微鏡觀察方法

取1 μL燕麥β－葡聚糖溶液滴加到新鮮切開的云母片表面。于干燥器中自然干燥2 h，然后將表面有樣品的云母片置于AFM上觀察。硅懸臂的彈性常數(shù)為23～91 N/m，驅(qū)動頻率為315 kHz。樣品掃描頻率為1～2 Hz。采用AJ在線和離線軟件采集和處理數(shù)據(jù)，并測量觀察對象的高度和寬度等數(shù)值。

1.3.4 燕麥β－葡聚糖的粒徑分布

按照前述方法制備1 mg/mL的燕麥β－葡聚糖溶液，然后分別稀釋成1、10、100 μg/mL的溶液。將不同質(zhì)量濃度的葡聚糖溶液于25℃測定粒度分布，所用的激光波長為632.8 nm，散射角為90°，每個質(zhì)量濃度的溶液測定3次以保證溶液達(dá)平衡狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度燕麥β－葡聚糖在溶液中的聚集狀態(tài)

燕麥β－葡聚糖即使在稀溶液中也可以形成聚集體結(jié)構(gòu)，10 μg/mL的燕麥β－葡聚糖溶液的AFM圖像如圖1a所示，圖中有許多直徑20～50 nm，截面高度3～5 nm的圓形聚集體結(jié)構(gòu)。這些小的球狀結(jié)構(gòu)可能是水溶液中燕麥β－葡聚糖分子之間纏繞所形成的聚集體。當(dāng)云母片上的溶液自然干燥之后，這些球狀的聚集體結(jié)構(gòu)坍縮成扁平的球體。另外，AFM針尖的增寬效應(yīng)也可能是這種具有扁平結(jié)構(gòu)的圖像的成因。隨著燕麥β－葡聚糖濃度的提高，溶液中逐漸形成越來越大的聚集體結(jié)構(gòu)(如圖1b和圖1c所示)。在圖1b中，燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度為20 μg/mL，其中的扁球狀聚集體的直徑介于200 nm至800 nm之間;圖1c中燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度為50 μg/mL，其中聚集體的直徑集中在600 nm至800 nm之間，分布較為均一，這些聚集體的截面高度約為3.6 nm。當(dāng)燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度上升至100 μg/mL 時，形成了長達(dá) 3 μm 的纖維狀結(jié)構(gòu)(圖1d)，這些微纖維的高度約為20 nm，寬度約為300 nm?？梢?，隨著燕麥β－葡聚糖濃度的升高，β－葡聚糖之間形成了越來越緊密的聚集體結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為，這種聚集效應(yīng)源于β－葡聚糖之間的氫鍵相互作用。當(dāng)提高β－葡聚糖的濃度時，β－葡聚糖分子之間有更多的機會通過熱運動而相互碰撞并形成聚集體結(jié)構(gòu)。這些AFM圖片提供了燕麥β－葡聚糖分子形成聚集體的直接證據(jù)，同時也說明燕麥β－葡聚糖因濃度效應(yīng)產(chǎn)生的聚集體大小不僅與其濃度成正相關(guān)，而且當(dāng)濃度達(dá)到一定大小時，聚集體結(jié)構(gòu)將發(fā)生質(zhì)的變化。從另一個角度提示，多糖的生物或生理效應(yīng)與其聚集體結(jié)構(gòu)相關(guān)。

圖1 不同質(zhì)量濃度燕麥β－葡聚糖在溶液中的聚集形態(tài)

2.2 存放不同時間后燕麥β－葡聚糖在溶液中的聚集狀態(tài)

將10 μg/mL的燕麥β－葡聚糖溶液于室溫下保存9 d以后觀察得到的AFM圖像如圖2所示。很明顯，其中形成了許多扁平的盤狀結(jié)構(gòu)，這些圓盤的直徑約為300 nm，高度介于15～20 nm之間。這種聚集態(tài)結(jié)構(gòu)顯示溶液中的燕麥β－葡聚糖分子可以自發(fā)通過碰撞和氫鍵而自組裝成相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，盡管這是一個相對緩慢的過程。

圖2 燕麥β－葡聚糖溶液于室溫存放9 d后的AFM圖像及其截面高度圖

2.3 燕麥β－葡聚糖單鏈的觀察

2.3.1 用SDS分散燕麥β－葡聚糖

鑒于燕麥β－葡聚糖在溶液中容易形成聚集體，所以采用添加表面活性劑的方法來分散這些聚集體以獲得單個的β－葡聚糖分子。結(jié)果表明，十二烷基磺酸鈉(SDS)可以有效地將β－葡聚糖分散成單個分子。圖3中顯示了有代表性的燕麥β－葡聚糖分子鏈形態(tài)。這些β－葡聚糖分子鏈的高度為(0.44±0.1)nm，寬度約2.8 nm。這一結(jié)果與硬葡聚糖的數(shù)據(jù)接近，硬葡聚糖是一種主鏈由β－(1→3)－D－葡萄糖殘基構(gòu)成并帶有(1→6)分支的葡聚糖，其單鏈高度經(jīng)X射線衍射測定為0.55 nm［7］。因為燕麥β－葡聚糖分子沒有支鏈，所以其分子鏈的高度略小于硬葡聚糖的鏈高。這些鏈高度數(shù)據(jù)說明用SDS確實可以將燕麥β－葡聚糖分散成單個分子。AFM圖片顯示這些單個的燕麥β－葡聚糖分子確實是一種線性無分支的多糖鏈。直觀的證實了前人的研究結(jié)果。

圖3 用SDS分散的單個燕麥β－葡聚糖分子

2.3.2 用Tween－20和Tween－80分散燕麥 β－葡聚糖

Tween－20和Tween－80也可以用來分散燕麥β－葡聚糖分子，但是所得到的葡聚糖的鏈高度超過1.0 nm，表明這些鏈不是單個的分子而可能是幾個分子并列所形成的復(fù)合體。另外將Tween－20加入葡聚糖溶液中時形成渾濁的溶液，而SDS加入葡聚糖中則形成澄清的溶液，反映出Tween－20和Tween－80并不能像SDS那樣有效的將燕麥β－葡聚糖分散成單個分子。這幾種表面活性劑分散能力的差異可能源于它們具有不同的疏水效應(yīng)和自身所帶的電荷。Tween－20和Tween－80是中性分子，它們比SDS更加疏水，而SDS是一種離子型的表面活性劑，且其分子具有較小的尺寸。因此SDS能夠進入β－葡聚糖分子間的空隙并通過和β－葡聚糖結(jié)合而破壞β－葡聚糖分子間的氫鍵，由于SDS帶負(fù)電荷，因此結(jié)合有SDS的β－葡聚糖分子之間會產(chǎn)生靜電排斥作用而有利于其分散。

2.4 不同濃度燕麥β－葡聚糖在溶液中的粒徑分布

圖4顯示，當(dāng)燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度從1 μg/mL上升至10 μg/mL時，其在水溶液中的粒徑稍有增加，當(dāng)β－葡聚糖的質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至100 μg/mL時，β－葡聚糖的粒徑顯著增加。這說明燕麥β－葡聚糖在水溶液中的聚集程度隨其質(zhì)量濃度而變化。當(dāng)燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度為1 μg/mL時，其粒徑為(926±28)nm，這與燕麥β－葡聚糖的分子鏈長度接近(938 nm，由AFM測定);當(dāng)燕麥β－葡聚糖的質(zhì)量濃度上升至10 μg/mL時，其粒徑為(1 191±78)nm，而相同質(zhì)量濃度時從AFM圖像中測量的顆粒直徑在20～50 nm之間，這一極大的差異說明當(dāng)10 μg/mL的燕麥β－葡聚糖溶液滴加至云母片表面并在空氣中干燥后，β－葡聚糖分子從松散的線型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成緊密的球狀結(jié)構(gòu)。可能是云母片表面β－葡聚糖溶液中水分的蒸發(fā)使得單個的β－葡聚糖在分子內(nèi)氫鍵的作用下形成了這種扁平的球狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)β－葡聚糖溶液的質(zhì)量濃度上升至100 μg/mL時，其在溶液中的粒徑為(2 023±180)nm，用原子力顯微鏡觀察到的纖維結(jié)構(gòu)的長度則超過3 000 nm，說明在此質(zhì)量濃度下燕麥β－葡聚糖可以形成膠束狀結(jié)構(gòu)。

圖4 燕麥β－葡聚糖在水溶液中的粒度分布

3 討論

原子力顯微鏡和粒度分析儀的測量結(jié)果都表明在水溶液中，燕麥β－葡聚糖的粒度隨著其濃度的上升而增大。但是兩者的測量結(jié)果并不一致，這一差異除了說明燕麥β－葡聚糖在水溶液中和在AFM測定條件下的構(gòu)象不同之外，還表明將β－葡聚糖溶液滴加到云母片表面的制樣方法并不能完全反映出β－葡聚糖在溶液中聚集的真實狀態(tài)。當(dāng)β－葡聚糖溶液被滴加至云母片表面時，由于水分的蒸發(fā)和表面張力的存在，可能導(dǎo)致其構(gòu)象的改變。而且AFM所得到的是β－葡聚糖分子在云母片表面的二維構(gòu)象，并不是三維形貌。所以利用AFM技術(shù)只能在一定程度上反映燕麥β－葡聚糖的狀態(tài)。要得到燕麥β－葡聚糖在溶液中的詳細(xì)信息，還需要借助其他手段。

因為燕麥β－葡聚糖分子在溶液中可以通過擴散而相互接近，并有可能在分子間作用力的影響下相互結(jié)合形成聚集體，所以將β－葡聚糖的稀溶液存放一定時間之后，在溶液中也可以形成聚集體。當(dāng)溶液濃度很低時，這是一個緩慢的過程。

燕麥β－葡聚糖之所以難以被分散是因為分子間的氫鍵相互作用，利用表面活性劑可以分散β－葡聚糖分子，這說明表面活性劑可以破壞這種氫鍵相互作用。同時也表明β－葡聚糖分子在某種程度上具有類似疏水性的特性，因此可以和SDS的疏水長鏈結(jié)合，從而被分散。

4 結(jié)論

隨著濃度的升高，燕麥β－葡聚糖在溶液中所形成的聚集體也隨之增大。低濃度的燕麥β－葡聚糖溶液在存放了一定時間之后，也可以形成類似的聚集體。通過加入離子型表面活性劑SDS，成功得到了燕麥β－葡聚糖的單分子。試驗表明AFM并不能完全反映出β－葡聚糖在溶液中聚集的真實狀態(tài)。因而研究多糖分子在溶液中的構(gòu)象時最好結(jié)合其它方法，這樣才能準(zhǔn)確描述多糖在溶液中的聚集狀態(tài)。

［1］Woodward J R，F(xiàn)incher G B，Stone B A.Water soluble(1→3)，(1→4)－β－D－glucans from barley(Hordeum vulgare)endosperm.II.Fine structure［J］.Carbohydrate Polymer，1983，3(3):207 －225

［2］Kerckhoffs D A，Hornstra G，Mensink R P.Cholesterol lowering effect of β－glucan from oat bran in mildly hypercholesterolemic subjects may decrease when β－glucan is incorporated into bread and cookies［J］.American Journal of Clinical Nutriton，2003，78(2):221 －227

［3］Grimm A，Kruger E，Burchard W.Solution properties of β －D － (1，3)(1，4)－ glucan isolated from beer［J］.Carbohydrate Polymers，1995，27(3):205 －214

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Characterization of Molecular Chain Morphology of Oat β－Glucan by Atomic Force Microscopy

Wu Jia1Deng Xiao2Xie Bijun3
(College of Biological Science and Technology，F(xiàn)uzhou University1，F(xiàn)uzhou 350108)
(Fujian Southeast Standard Certification Center2，F(xiàn)uzhou 350002)
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University3，Wuhan 430070)

Effects of concentration and storage time on aggregation states of oat β－glucan were studied by the atomic force microscopy(AFM).SDS，Tween－20 and Tween－80 were used to disperse the aggregates and the effectiveness was investigated.The sizes of the aggregates were measured by a particle size analyzer and AFM，and then the values from two methods were compared.The results indicated that the sizes of the aggregates increased with increasing concentration.Aggregates could also be observed when a diluted β － glucan solution was stored for a certain time.SDS，a surfactant，could disperse the aggregates into single molecules in 1μg/mL β － glucan solution effectively.The shape of the single molecular chain was observed by AFM.There were differences in the size of aggregates measured by the particle size analyzer and AFM，which might be related to the sample preparation method of AFM.

oat，β － glucan，atomic force microscopy，molecular chain morphology

TS201.2

A

1003－0174(2011)10－0040－05

“十一五”國家科技支撐計劃(2006BAD27B09)

2010－12－15

吳佳，男，1980年出生，講師，碩士生導(dǎo)師，食品化學(xué)

謝筆鈞，女，1942年出生，教授，博士生導(dǎo)師，食品化學(xué)與天然產(chǎn)物化學(xué)