小鼠止血帶休克后腎組織ACE/ACE2表達變化及意義*

王建軍， 楊秀紅, △， 鄧 巍， 王銀環(huán)， 劉英超， 耿 菲， 王建輝， 秦 川, 張連元

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生理教研室,2機能實驗室，河北 唐山 063000；3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，北京 100021)

小鼠止血帶休克后腎組織ACE/ACE2表達變化及意義*

王建軍1， 楊秀紅1, 2 △， 鄧 巍3， 王銀環(huán)2， 劉英超1， 耿 菲2， 王建輝2， 秦 川3, 張連元2

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生理教研室,2機能實驗室，河北 唐山 063000；3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，北京 100021)

目的： 通過觀察小鼠止血帶休克(TS)后，不同時點血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)在腎臟的表達變化與腎損傷程度的關(guān)系，探討ACE/ACE2表達失衡在TS后腎損傷中的作用。方法復(fù)制小鼠TS模型，Western blotting測肢體缺血再灌注后12 h內(nèi)腎組織ACE和ACE2蛋白的表達；利用化學(xué)比色方法測定血清和腎組織丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；制作腎病理切片，觀察腎組織形態(tài)變化，并利用免疫組織化學(xué)方法觀察ACE和ACE2的表達部位。結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示，各時點與對照組比較，TS后ACE表達升高，ACE2表達降低；與對照組比較血清和腎MDA水平增高(Plt;0.05)，SOD活性降低(Plt;0.05)；HE病理切片顯示，TS后各時點腎組織有充血、炎細胞浸潤等不同程度損傷；免疫組化結(jié)果顯示，ACE在腎小管上皮細胞胞漿表達，TS后表達明顯增強；ACE2主要在腎小管上皮細胞管腔膜表達，TS后表達明顯降低。結(jié)論TS后腎組織ACE表達升高，ACE2表達降低，ACE/ACE2表達失衡可能與腎損傷有關(guān)。

休克,止血帶； 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶； 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2； 腎損傷

各種原因所致休克發(fā)生機制極為復(fù)雜，體液因素在休克過程中發(fā)揮了重要作用，其中腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)活性增高并參與休克發(fā)生，主要是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme 2，ACE)催化的縮血管通路過度激活引起血管收縮，造成局部組織器官缺血缺氧導(dǎo)致多器官損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)，RAS系統(tǒng)還存在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)[1]催化的舒血管通路，ACE2能夠起到拮抗ACE的作用，保護休克時對局部器官的損傷。本研究以小鼠止血帶休克(tourniquet shock，TS)為模型，觀察TS后ACE、ACE2的表達變化與腎損傷的關(guān)系，旨在探討RAS穩(wěn)態(tài)失衡在休克發(fā)生機制中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Western blotting蛋白marker、ECL發(fā)光劑、定影劑和顯影劑均為碧云天試劑公司產(chǎn)品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。ACE抗體、ACE2抗體和β-actin抗體均購自Abcam。免疫組化II抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2動物 雄性健康ICR小鼠42只，月齡6個月，由北京實驗動物研究所提供。

2方法

2.1模型復(fù)制 采用我室常規(guī)復(fù)制小鼠TS模型，水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，用橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎小鼠雙后肢根部，阻斷血流2 h后松開橡皮帶使血流再灌注，于不同時點摘眼球放血處死小鼠，取血漿和雙側(cè)腎組織，-70 ℃冰箱或固定液中保存待各指標測定。

2.2動物分組 隨機分為7組：(1)對照組(control)常規(guī)飼養(yǎng)，不結(jié)扎雙后肢，其余操作同模型組。(2)止血帶休克組(TS組)根據(jù)再灌注時間不同分為6組，分別為0.5 h組、1 h組、2 h組、4 h組、6 h組和12 h組。

2.3Western blotting測定腎組織ACE、ACE2蛋白表達 按照蛋白提取試劑盒說明進行操作。將一側(cè)腎組織100 mg放入玻璃勻漿器，加入1 mL蛋白裂解液勻漿，12 000 r/min離心5 min，留取上清。用BCA法測定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白配成濃度為6 g/L，取10 μL蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜3～5 h，5%BSA室溫封閉1 h，I抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，Ⅱ抗孵育0.5 h，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL發(fā)光試劑均勻鋪于膜上孵育2 min，曝光后顯影、定影。結(jié)果用ImageJ圖像分析軟件分析處理。

2.4HE染色觀察腎臟病理損害 將另一側(cè)腎浸于10%甲醛中充分固定后，按常規(guī)方法脫水、包埋、切片和HE染色，顯微鏡下觀察。

2.5免疫組織化學(xué)方法檢測腎組織ACE、ACE2的表達部位 將腎組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。3%H2O2室溫下孵育10 min，枸櫞酸緩沖液中高溫修復(fù)2～3 min，冷卻至室溫，加入Ⅰ抗孵育1.5 h，PBS沖洗5 min×3次，加入Ⅱ抗試劑Ⅰ37 ℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次，加入Ⅱ抗試劑Ⅱ37 ℃孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

2.6SOD活性、MDA含量測定 待全血凝固后，3 000 r/min離心5 min取上清。將腎組織勻漿，離心、提取上清。根據(jù)試劑盒說明，用酶標儀測定血清和腎組織SOD活性及MDA含量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1Westernblotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，在180 kD處可見到ACE表達條帶，TS后各時點組小鼠腎組織ACE蛋白表達量比對照組增高。在120 kD處可見到ACE2表達條帶，TS后各時點組小鼠腎組織ACE2蛋白表達量比對照組降低，見圖1A。ACE/ACE2比值于再灌注后2 h最大，見圖1B。

Figure 1. The change of ACE and ACE2 expression in the kidney after TS observed by Western blotting. A: the protein expression of ACE and ACE2; B: the ratio of ACE to ACE2.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control (0 h).

2HE結(jié)果

HE病理切片顯示，與正常對照組(圖2A)比較,TS后腎組織有不同程度損傷，再灌注早期腎小球毛細血管明顯擴張充血，炎細胞浸潤，再灌注4 h炎癥最為明顯，可以看到大量炎細胞浸潤；再灌注晚期近曲小管上皮細胞水腫，細胞體積增大，官腔變窄，偶見上皮細胞壞死，見圖2B。

3免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，ACE在腎小管上皮細胞胞漿表達，TS后表達明顯增強；ACE2主要在腎小管上皮細胞管腔膜表達，TS后表達明顯降低。利用BI 2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行分析，測定吸光度值，進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：與對照組相比，TS后腎組織ACE和ACE2表達均有顯著差異(Plt;0.05)，見圖3。

Figure 2. The kidney injury after TS observed by HE staining (×100). A: normal kidney; B: the injured kidney after TS.

Figure 3. The expression of ACE2 and ACE in the kidney(immunohistochemical staining,×200).A:the expression of ACE2 in normal kidney;B:the expression of ACE2 in the kidney after TS;C: the expression of ACE in nomal kidney, D: the expression of ACE in the kidney after TS. ±s.n=6.*Plt;0.05 vs control.

4SOD活性和MDA含量測定結(jié)果

與對照組比較，各時點TS后血清、腎組織SOD活性均顯著降低(Plt;0.05或Plt;0.01)，見表1；MDA含量均顯著增高(Plt;0.05或Plt;0.01)，見表2。

討 論

休克的發(fā)病機制非常復(fù)雜，其最根本機制是循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂，特別是急性微循環(huán)障礙導(dǎo)致多器官功能衰竭。體液因素在休克過程中發(fā)揮了重要作用，其中腎素血管緊張素系統(tǒng)激活與休克的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來研究發(fā)現(xiàn)，RAS包括兩條通路：一條是由ACE催化的縮血管通路，ACE將血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅰ轉(zhuǎn)換成AngⅡ，AngⅡ與血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)結(jié)合產(chǎn)生縮血管、促炎癥等作用[2]；另一條是由ACE2催化的舒血管通路，ACE2的主要作用是分解AngⅡ并產(chǎn)生Ang(1-7)，Ang(1-7)可與MAS受體結(jié)合可產(chǎn)生舒張血管[3]、調(diào)節(jié)血壓[4]、提高缺血再灌耐受性等作用[5]。兩條軸的平衡在維持機體體液平衡、血壓穩(wěn)定、細胞增殖、心和腎功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。休克時可造成局部組織器官的損傷，尤其是心、肺、腎等重要器官的損傷，可能與局部器官兩條通路的失調(diào)有關(guān)。

表1 TS后各時點SOD活性

表2 TS后各時點MDA含量

ACE是縮血管通路的關(guān)鍵酶，休克時其活性過度增高，催化底物產(chǎn)生大量AngⅡ，作用于AT1R發(fā)揮相應(yīng)作用，Gupta等[6]研究表明內(nèi)毒素休克大鼠腎ACE和AngⅡ表達增高，并出現(xiàn)腎小管周圍毛細血管血流量減少，血尿素氮增高等急性腎衰竭癥狀，活化蛋白C(activated protein C, APC)可以通過下調(diào)AngⅡ和ACE mRNA的表達來增加腎血流量和減少血尿素氮，從而減輕腎損害。有研究表明，腎缺血2 h，再灌4 h可對腎組織造成嚴重損傷，同時ACE和AngⅡ表達升高[7]。Nitescu等[8]研究表明AT1R抑制劑坎地沙坦能夠使內(nèi)毒素休克大鼠腎內(nèi)血流量和氧分壓增高，從而減輕休克時造成的腎損害。然而也有研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制劑依那普利并沒有改變內(nèi)毒素血癥黏附分子的水平[9]。

ACE2是舒血管通路的關(guān)鍵酶，其活性增高可分解AngⅡ并產(chǎn)生具有舒血管作用的Ang(1-7) 。休克時ACE2的低表達可能會進一步升高AngⅡ水平對機體造成不利影響。研究表明，脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克大鼠可出現(xiàn)腎衰竭癥狀，APC可以通過上調(diào)ACE2 mRNA的表達水平來緩解內(nèi)毒素休克引起的腎衰竭[6]。腎缺血再灌注損傷時組織ACE2表達明顯下降[7]。在其它疾病所致的腎損傷中也發(fā)現(xiàn)與ACE/ACE2表達失衡有關(guān)。Shiota等[10]研究表明在鏈霉素誘導(dǎo)的糖尿病中，ACE2基因敲除小鼠腎損傷發(fā)生的較早而且損傷更加嚴重。有研究表明，腎組織ACE2降低可能提高AngⅡ水平引起腎氧化應(yīng)激，導(dǎo)致炎癥和纖維化等腎損傷性疾病[11]。

目前有關(guān)ACE/ACE2在TS中的作用研究尚未見報道。本實驗的前期實驗發(fā)現(xiàn)[12]，TS后腎損傷可能與內(nèi)皮源性NO表達降低有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，TS后各時點腎組織有不同程度的炎癥性損傷，其中以4 h損傷最為嚴重。具有抗氧化作用的酶SOD活性降低，而過氧化產(chǎn)物MDA含量卻增高。同時實驗結(jié)果還顯示TS后腎組織ACE的表達升高，ACE2的表達降低，ACE/ACE2表達失衡。這提示腎組織ACE/ACE2表達失衡可能是引起TS后腎損傷的因素之一，ACE/ACE2表達失衡是否與內(nèi)皮源性NO表達降低有關(guān)有待進一步研究。

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ChangeofACE/ACE2expressioninmousekidneyaftertourniquetshock

WANG Jian-jun1, YANG Xiu-hong1, 2, DENG Wei3, WANG Yin-huan2, LIU Ying-chao1, GENG Fei2, WANG Jian-hui2, QIN Chuan3, ZHANG Lian-yuan2

(1DepartmentofPhysiology,2LaboratoryofFunctionalScience,SchoolofBasicMedicalSciences,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China;3InstituteofLaboratoryAnimalScience,ChineseAcademyofMedicalScienceandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China.E-mail:yangxiuhong38@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the change of angiotensin-converting enzyme/angiotensin-converting enzyme 2(ACE/ACE2) expression in mouse kidney after tourniquet shock (TS) and to study the effects of ACE/ACE2 imbalance on the kidney of TS mice.METHODSThe male ICR mice were used in the study. The model of TS was made using bilateral tourniquets placed high in the inguinal region on both hind legs for 2 h to induce ischemia, and reperfusion was initiated by cutting latex rings. The expression of ACE/ACE2 in the kidney at different time points was determined by Western blotting and immunohistochemistry. The content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the kidney were determined by chemical colorimetric method. The morphological changes of the kidney were observed under microscope with HE staining.RESULTSWestern blotting showed that ACE was increased and ACE2 was decreased in the kidney after TS. MDA was increased and SOD was decreased in TS groups as compared with control group. The kidney of TS groups displayed distinct injuries including inflammatory cell infiltration and degeneration of tubule epithelial cells. The results of immunohistochemistry showed that ACE expressed in endochylema of the renal tubular epithelial cells was increased and ACE2 expressed in epithelium of proximal tubules was decreased in the TS mice.CONCLUSIONBoth ACE and ACE2 are expressed in the kidney. The imbalance of ACE/ACE2 expression in the kidney after TS may be related to the kidney injury.

Shock,tourniquet; Angiotensin-converting enzyme; Angiotensin-converting enzyme 2; Renal injury

1000-4718(2011)12-2399-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.031

2011-06-08

2011-11-17

衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題(No. ZDS200801)；唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(No.10150204A-10)

△通訊作者 Tel：0315-3726387；E-mail:yangxiuhong38@yahoo.com.cn