類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者caspase-7β亞型基因的多態(tài)性分析*

江雨霏， 沈 波， 金 翔， 陳佳喜， 朱 敏

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬浙江省臺(tái)州醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 317000)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者caspase-7β亞型基因的多態(tài)性分析*

江雨霏， 沈 波△， 金 翔， 陳佳喜， 朱 敏

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬浙江省臺(tái)州醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 317000)

目的： 探討中國(guó)臺(tái)州地區(qū)caspase-7 β亞型基因rs2227309多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)易感性的關(guān)系。方法對(duì)204位類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與203位健康體檢者進(jìn)行研究，采用熒光定量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析的方法對(duì)caspase-7 β亞型基因rs2227309多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果RA患病組中GG、AG、AA基因型頻率分別為33.3%、53.4%、13.2%，健康對(duì)照組中GG、AG、AA基因型頻率分別為33.0%、44.3%、22.7%。RA患者組與健康對(duì)照組相比，caspase-7 β亞型基因rs2223709基因型分布的差異顯著(Plt;0.05)。RA患病組GG+AG基因型頻率高于健康對(duì)照組，差異顯著(Plt;0.05，OR=1.921，95%CI為1.140～3.236)。RA患者組與健康對(duì)照組中G等位基因頻率分別為60.0%與55.2%。RA患者組與健康對(duì)照組相比，等位基因分布的差異不顯著(Pgt;0.05，OR=1.221，95%CI為0.924～1.613)。結(jié)論Caspase-7 β亞型基因rs2227309可能與中國(guó)臺(tái)州地區(qū)人群類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性有關(guān)，這種關(guān)系可能是由于caspase-7非功能亞型轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)升高致使滑膜細(xì)胞凋亡活性減弱所致。

Caspase-7 β亞型； 基因多態(tài)性； 關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕性

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病?；ぱ壮志梅磸?fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，最終殘廢。RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]，但已發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與環(huán)境、細(xì)胞、病毒、遺傳、性激素及神經(jīng)精神狀態(tài)等因素有關(guān)，特別是與滑膜細(xì)胞凋亡減弱密切相關(guān)[2]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteases, caspases)是一組在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶[3]，可能與RA易感性有關(guān)。但RA患者接受不同藥物治療，凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)容易受到其影響而出現(xiàn)干擾性差異。于是本研究擬通過(guò)檢測(cè)調(diào)查人群中caspase-7 β亞型基因rs2227309 (G/A)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，探討中國(guó)臺(tái)州地區(qū)漢族人群caspase-7 β亞型基因多態(tài)性與RA易感性的相關(guān)性，從而為探索RA的發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。

材 料 和 方 法

1對(duì)象

實(shí)驗(yàn)分RA患病組與健康對(duì)照組。(1) RA患病組：RA患者204例，選取2009年1月至2010年11月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院就診的患者，其中男50例，女154例，年齡20～82歲，平均年齡(51.6±11.5)歲。診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的RA分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2) 健康對(duì)照組：選取2010年11月至12月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院體檢中心檢查的健康者203例，無(wú)關(guān)節(jié)畸形，排除各種全身性炎癥疾病。其中男49例，女154例，年齡22～86歲，平均年齡(51.8±10.1)歲。以上研究對(duì)象均在知情同意的情形下取得。全部研究對(duì)象均來(lái)自臺(tái)州地區(qū)漢族人群，且無(wú)親緣關(guān)系。

2主要試劑

人全血基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，TaqMan? 熒光定量SNP分析探針以及PCR mix均購(gòu)自Applied Biosystems。儀器使用Applied Biosystems公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR System。

3方法

3.1標(biāo)本收集與保存 空腹抽取研究對(duì)象靜脈血2 mL并以EDTA抗凝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2白細(xì)胞基因組DNA抽提 取上述抗凝血500 μL，按照全血基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3Caspase-7基因型鑒定應(yīng)用 使用Applied Biosystems公司的TaqMan?熒光定量SNP分析探針(TaqMan? SNP Genotyping Assays)，探針的熒光染料分別為綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein, VIC)與羧基熒光素(carboxyfluorescein, FAM)，其檢測(cè)的具體序列如圖1，VIC標(biāo)記的探針檢測(cè)A等位基因，F(xiàn)AM標(biāo)記的探針檢測(cè)G等位基因?？偡磻?yīng)體系為20 μL，選用96孔板，每板設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)2次，若2次結(jié)果存在差異，或者其中1次結(jié)果模糊不清，則進(jìn)行復(fù)查。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，預(yù)變性95 ℃ 10 min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。

Figure 1. Caspase-7 rs2227309 gene sequences.

圖1Caspase-7rs2227309基因序列

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件包完成。RA患病組與健康對(duì)照組之間性別比對(duì)檢驗(yàn)采用2檢驗(yàn)，年齡比對(duì)檢驗(yàn)采用成組t檢驗(yàn)。基因型頻率采用累積計(jì)算法求得，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用2檢驗(yàn)。由基因型頻率直接計(jì)算等位基因頻率，組間基因型及等位基因頻率比較采用2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1RA患者組和健康對(duì)照組基本特征

如表1所示，RA患者組與健康對(duì)照組年齡和性別無(wú)顯著差異。RA患者組病程為(10.1±8.2) 年，血清類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體陽(yáng)性率分別為84.8%和92.6%；健康對(duì)照組未檢出上述RA相關(guān)血清因子。

表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臨床資料及分組信息

2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

3RA患者組和健康對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率分布比較

表2顯示，RA患者組的GG與GA基因型總和高于健康對(duì)照組，Plt;0.05，差異顯著。

表3顯示，RA患者組等位基因G的比例略高于健康對(duì)照組，Pgt;0.05，差異不顯著。

表2 RA與健康對(duì)照組caspase-7 rs2227309基因型相對(duì)危險(xiǎn)度分析

表3 RA與健康對(duì)照組caspase-7 rs2227309等位基因相對(duì)危險(xiǎn)度分析

討 論

RA是一種病因?qū)W尚未完全明了的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要特征為持續(xù)性滑膜組織炎癥和漸進(jìn)性關(guān)節(jié)破壞。即滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，最終殘廢。RA是最常見(jiàn)的風(fēng)濕性疾病之一，分布于所有的種族和民族，可發(fā)生于任何年齡段，但隨著年齡的增加其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?；颊吣信壤ǔ?∶3。

本病的病因尚未完全明確，一般認(rèn)為，RA是具有遺傳傾向的易感人群在受到未知抗原刺激后所產(chǎn)生的自身免疫反應(yīng)性疾病，發(fā)病與環(huán)境、細(xì)胞、病毒、遺傳、性激素及神經(jīng)精神狀態(tài)等多種因素有關(guān)[4]。目前研究顯示，成骨細(xì)胞增生與滑膜巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞凋亡減弱的不平衡可能是導(dǎo)致RA持續(xù)發(fā)展的一個(gè)機(jī)制。RA患者成骨細(xì)胞的凋亡增加可能致關(guān)節(jié)周?chē)菗p害，而類(lèi)風(fēng)濕滑膜細(xì)胞的凋亡削弱似乎導(dǎo)致滑膜組織增生[2]。并且，動(dòng)物研究表明，在關(guān)節(jié)炎模型中，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的增加，改善了滑膜組織的增生[5-6]。

Caspases是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Caspase與多數(shù)蛋白酶一樣在胞內(nèi)以無(wú)活性的酶原形式存在，酶原由N-端前結(jié)構(gòu)域(prodomain)、大約20 kD的大亞基(p20)和大約10 kD的小亞基(p10)3部分組成。成熟caspases酶蛋白都須通過(guò)水解prodomain序列，分別由2個(gè)p20亞基和2個(gè)p10亞基進(jìn)行組裝，從而激活[7]。活化的caspase可水解底物,并通過(guò)級(jí)聯(lián)放大誘發(fā)凋亡。目前已發(fā)現(xiàn)的caspases有14種, 分為炎癥caspases、啟動(dòng)子caspases和效應(yīng)子caspases 3類(lèi)[8]。根據(jù)起始激活的caspase不同，凋亡激活途徑分為3種，而最終都導(dǎo)致效應(yīng)子caspases(caspase-3、caspase-6和caspase-7)的反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[9]。

大鼠實(shí)驗(yàn)表明，缺乏caspase-7會(huì)導(dǎo)致凋亡減弱[10]。基于caspase-7在凋亡中的作用，它可能是自身免疫性疾病易感性的影響因素之一。但是由于RA患者接受不同藥物的治療，并且許多治療可能影響到凋亡途徑，因此直接檢測(cè)caspase-7蛋白表達(dá)容易受其影響。而caspase-7基因定位于10q25.1-10q25.2，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其相鄰區(qū)域10q21和10q26與RA的易感性有關(guān)[11]，于是近年來(lái)出現(xiàn)針對(duì)caspase-7基因多態(tài)性與RA易感性的研究。

本實(shí)驗(yàn)中, 健康對(duì)照組人群中rs2227309位點(diǎn)上AA基因型者占全組人群的22.7%，AG基因型者占全組人群的44.3%，GG基因型者占全組人群的33.0%，基本符合此前研究公布的基因頻率。RA患病組中，AA基因型患者占全組人群的13.2%，AG基因型患者占全組人群的53.4%，GG基因型患者占全組人群的33.3%。RA患病組AG+GG基因型含量相對(duì)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)而分析其等位基因，健康對(duì)照組人群中A等位基因占44.8%，G等位基因占55.2%；RA患者組A等位基因占40.0%，G等位基因占60.0%。RA患者組G等位基因的頻率較健康對(duì)照組略高，但差異不顯著。我們可以假設(shè)RA患者組AG基因型與GG基因型的比例均高于健康對(duì)照組，所以基因型差異比較顯著，而RA患者G等位基因的增高并不明顯。

我們發(fā)現(xiàn)GG基因型與AG基因型合并組的危險(xiǎn)度最高(OR=1.921，95%CI:1.140～3.236，Plt;0.05)。而AG基因型頻率OR=1.441，GG基因型頻率OR=1.015，即AG基因型與RA易感性的關(guān)系更加顯著。這也可以解釋RA患者單獨(dú)G等位基因的增高并不顯著。我們推測(cè)，caspase-7 rs2227309基因位點(diǎn)GG+AG基因型頻率與RA的易感性有關(guān)。

如今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)caspase-7基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行不同剪切拼接可以產(chǎn)生4種mRNA，編碼3種不同的caspase-7亞型。其中最大的亞型為δ亞型，由mRNA的δ型(又稱(chēng)為α’型)編碼。Caspase-7 α亞型是一個(gè)有303個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，屬于功能亞型，參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，由mRNA的α型或γ型編碼。此外，caspase-7 β亞型是其最小的亞型，由253個(gè)氨基酸殘基組成，它與α亞型的C端序列不同，缺乏酶的活性位點(diǎn)，可能作為主要的caspase-7活性形式抑制劑，由mRNA的β型編碼[12-13]。Caspase-7 rs2227309編碼定位于蛋白的C-末端，對(duì)非β亞型無(wú)影響，在β亞型產(chǎn)生K249R的改變[14]。既往研究表明，其改變可能引起caspase-7 β亞型mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高[15-16]，從而導(dǎo)致凋亡減弱，滑膜細(xì)胞增生，參與RA的發(fā)病。

綜上所述，在RA患者組與健康對(duì)照組中，caspase-7 β亞型基因rs2227309基因型分布具有差異，這可能是通過(guò)引起caspase-7非功能亞基的相對(duì)表達(dá)量升高，而導(dǎo)致滑膜細(xì)胞凋亡減弱，參與RA的發(fā)病。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)caspase-7基因多態(tài)性與RA的相關(guān)性研究。我們可以通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)中國(guó)地區(qū)RA患病者caspase-7 β亞基的含量進(jìn)而探討其在RA發(fā)病中的作用。同時(shí)，我們也可以通過(guò)檢測(cè)caspase-7在凋亡通路中上游或者下游分子成分的改變，明確凋亡對(duì)于RA發(fā)病的具體作用。從而為探討RA的發(fā)病機(jī)制，對(duì)其進(jìn)行早期預(yù)防、早期診斷、早期治療提供新的思路。

[1]陳瑞林,陶 怡,黃文輝.類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎CD4+CD28-T細(xì)胞與淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(9)：1824-1827.

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Geneticpolymorphismofcaspase-7isoformβinpatientswithrheumatoidarthritis

JIANG Yu-fei, SHEN Bo, JIN Xiang, CHEN jia-xi, ZHU Min

(DepartmentofClinicalLaboratory,TaizhouHospital,WenzhouMedicalCollege,Taizhou317000,China.E-mail:shenbkz@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the association between the rs2227309 polymorphism of cysteinyl aspartate-specific protease-7 (caspase-7) isoform β and the genetic susceptibility in rheumatoid arthritis (RA) patients in Taizhou of China.METHODSGenotyping of rs2227309 of caspase-7 isoform β gene was performed in 204 RA patients and 203 matched healthy controls using TaqMan single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assays.RESULTSThe genotype frequencies of GG, AG and AA of caspase-7 polymorphism in the RA patients were 33.3%, 53.4% and 13.2%, respectively, and 33.0%, 44.3% and 22.7% in the healthy individuals,respectively. There was a significant difference in caspase-7 genotype frequencies between the RA patients and healthy controls (Plt;0.05). The frequency of GG+AG genotype in RA patients was higher than that in healthy controls with significant difference (Plt;0.05, OR=1.921, 95%CI: 1.140～3.236). The frequencies of the G allele were 60.0% and 55.2% in the RA patients and the healthy individuals,respectively. No significant difference was observed in allele frequency between the RA patients and healthy controls (Pgt;0.05, OR=1.221, 95%CI: 0.924～1.613).CONCLUSIONThe rs2227309 polymorphism of caspase-7 isoform β gene is associated with the susceptibility to rheumatoid arthritis. The high production of the non-functional variant of caspase-7 may reduce the apoptosis of rheumatoid synovial cells, indicating the mechanism of this association.

Caspase-7 isoform β; Genetic polymorphism; Arthritis,rheumatoid

1000-4718(2011)12-2368-04

R593.22

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.024

2011-08-10

2011-10-13

浙江省科技廳公益技術(shù)社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.2010C33001)；臺(tái)州市科技計(jì)劃(No.102KY09)

△通訊作者 Tel: 0576-85199345 ; E-mail：shenbkz@yahoo.com.cn