間歇低氧小鼠胰腺β細胞凋亡及其機制的實驗研究

李 光， 柴文戍， 康 健

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，遼寧 錦州 121000; 2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，遼寧 沈陽 110001)

間歇低氧小鼠胰腺β細胞凋亡及其機制的實驗研究

李 光1， 柴文戍1， 康 健2△

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，遼寧 錦州 121000;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，遼寧 沈陽 110001)

目的探討間歇低氧對小鼠胰腺β細胞凋亡的影響及其可能機制。方法將30只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為間歇低氧組、持續(xù)低氧組和正常對照組，每組10只。實驗結(jié)束后測定各組小鼠的胰島素耐量；采用化學(xué)比色法測定胰腺組織丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；用real-time PCR檢測小鼠胰腺組織中錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GPx1) mRNA的表達水平；并用TUNEL染色檢測胰腺β細胞凋亡。結(jié)果間歇低氧組小鼠胰島素抵抗水平及胰腺組織中MDA水平顯著高于正常對照組和持續(xù)低氧組 (Plt;0.01)；胰腺組織SOD活性顯著低于正常對照組和持續(xù)低氧組(Plt;0.01)；抗氧化酶MnSOD和GPx1 mRNA的表達水平顯著低于正常對照組和持續(xù)低氧組 (Plt;0.01)；而胰腺β細胞凋亡率顯著高于正常對照組和持續(xù)低氧組(Plt;0.01)。持續(xù)低氧組與正常對照組上述各種指標的比較均無顯著差異(均Pgt;0.05)。結(jié)論間歇低氧可導(dǎo)致胰腺組織氧化應(yīng)激狀態(tài)和胰腺β細胞凋亡，這可能是阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者胰島素抵抗及2型糖尿病的病理生理基礎(chǔ)之一。

間歇低氧; 胰島素抵抗; β細胞; 細胞凋亡

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAHS)是臨床上常見的綜合征，在美國等西方國家，其發(fā)病率男性約為4%，女性約為2%[1]。越來越多的證據(jù)表明OSAHS與胰島素抵抗/2型糖尿病相關(guān)，且獨立于肥胖的程度，這提示OSAHS可能是胰島素抵抗/2型糖尿病一種新的風(fēng)險因子。β細胞功能受損對于糖尿病的形成是必要的，因此為了更好地理解OSAHS與2型糖尿病的關(guān)系，需要探討是否OSAHS或間歇低氧(intermittent hypoxia，IH)通過氧化應(yīng)激損害胰腺β細胞，進而導(dǎo)致胰島素抵抗/2型糖尿病。為此，我們選用間歇低氧小鼠模型，模擬OSAHS患者存在的低氧/再氧合病理生理過程，觀察胰島素抵抗、氧化應(yīng)激狀態(tài)與胰腺β細胞凋亡的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1材料 30只8-12周的雄性健康清潔級C57BL/6J小鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重為(22±2)g，間歇低氧造模設(shè)備(Oxycycler Model A84XO; BioSpherix Instruments)，氧氣和氮氣(沈陽沈標氣體有限公司)，諾和靈R(諾和諾德公司)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Trizol試劑(Invitrogen Life technologies)，熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物)，缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)法試劑盒(武漢博士德生物工程公司)，PCR擴增儀(Biometra)。

1.2間歇低氧動物模型的制備 用隨機數(shù)字表法將大鼠分為間歇低氧組(intermittent hypoxia group,IH)、持續(xù)低氧組(sustained hypoxia group, SH)和正常對照組(control group,CON)，每組各10只。間歇低氧組小鼠置于間歇低氧造模設(shè)備中，使氧濃度變化于5%-21%，每天持續(xù)8 h，共2周；持續(xù)低氧組大鼠置于常壓低氧箱中，每天持續(xù)8 h，調(diào)節(jié)充入的氮氣流量，維持箱內(nèi)氧濃度為(5±1)%，共2周；正常對照組置于相同培養(yǎng)箱中，空氣條件下飼養(yǎng)2周。以上各組動物均于實驗2周后取材。

2方法

2.1胰島素耐量試驗 各組小鼠于實驗的最后8 h空腹，實驗結(jié)束后立即按0.75 U/kg劑量腹腔注射短效胰島素，于注射前(0 min)和注射后15、30、60、90 min時剪尾尖采血以羅氏(Roche)優(yōu)越型血糖儀測定血糖水平。以0 min時血糖水平作為參比基礎(chǔ)，測定在此基礎(chǔ)上每一時點血糖比率。

2.2氧化應(yīng)激指標的檢測 采用化學(xué)比色法測定胰腺組織MDA含量和SOD活性。

2.3Real-time PCR檢測小鼠胰腺組織中錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx1) mRNA的表達 采用Trizol從胰腺組織塊中抽提總RNA，操作按說明書進行，并行RNA的純度及定量檢測，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用PCR擴增儀進行基因擴增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，42個循環(huán)擴增。β-actin作為內(nèi)參照。所用β-actin、MnSOD和GPx1引物序列用Primer 5.10軟件設(shè)計，由北京華大基因公司合成。β-actin 上游引物5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG -3’，下游引物5’-TGTCACGCACGATTTCC-3’ ，PCR產(chǎn)物長度217 bp。MnSOD上游引物5’-GAGCACGCTTACTACCTTC-3’ ，下游引物5’-AACATTCTCCCAGTTGATTAC-3’，PCR產(chǎn)物長度84 bp。GPx1 上游引物5’-GCTCACCCGCTCTTTACC-3’，下游引物5’-GCCGCCTTAGGAGTTGC-3’ ，PCR產(chǎn)物長度255 bp。ABI Prism 7300SDS軟件記錄數(shù)據(jù)并分析，將目的基因的Ct用小鼠β-actin的Ct值進行標準化，根據(jù)比較法計算基因表達相對量，采用2-ΔΔCt計算基因表達的相對倍數(shù)變化。

2.4胰腺β細胞凋亡的檢測 使用TUNEL評估胰腺切片β細胞死亡，TUNEL染色方法根據(jù)廠商說明書使用。簡單地說，胰腺切片通過20 mg/L蛋白酶K預(yù)處理15 min，且用正常驢血清和BAS溶液所阻滯，平衡后，TdT酶在37 ℃時加入切片中1 h，在應(yīng)用Stop溶液后用10 mmol/L PBS溶液沖洗切片，在室溫下滴加抗地高辛配基軛合物0.5 h。然后切片采用胰島素雙重染色。TUNEL染β細胞核(綠色)，胰島素染細胞漿(紅色)。每個胰島TUNEL染色陽性的β細胞平均數(shù)×1 000(計數(shù)每組5只小鼠，每只小鼠15個切片所有胰島上的TUNEL染色陽性β細胞數(shù)后，再計算每個胰島TUNEL染色陽性的β細胞平均數(shù))，比較3組小鼠胰腺β細胞凋亡率，圖像原始放大倍數(shù)為×200。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1各組小鼠胰島素耐量試驗的測定

小鼠間歇低氧暴露2周后，與對照組相比，胰島素敏感性降低，即胰島素抵抗增加(Plt;0.01)；SH組與對照組胰島素敏感性無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖1。

Figure 1. Insulin tolerance test for mice in all groups. ±s.n=5.**Plt;0.01 vs CON group.

2各組小鼠胰腺氧化應(yīng)激指標的比較

間歇低氧暴露后，小鼠胰腺組織MDA水平較對照組明顯增高，而SOD水平較對照組顯著降低(Plt;0.01)；SH組與對照組氧化應(yīng)激指標的比較無顯著差異(Pgt;0.05)，見表1。

表1 各組小鼠胰腺組織氧化應(yīng)激指標的比較

3各組小鼠胰腺組織中MnSOD和GPx1的mRNA水平表達

間歇低氧暴露后，小鼠胰腺組織MnSOD和GPx1 mRNA表達水平較對照組明顯降低(Plt;0.01)；SH組與對照組MnSOD和GPx1的mRNA表達水平比較無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖2。

4各組小鼠胰腺β細胞凋亡的比較

間歇低氧后胰腺β細胞凋亡率增加4倍多，顯著高于對照組和SH組(Plt;0.01)，對照組和SH組胰腺β細胞的凋亡率比較無顯著差異(Pgt;0.05),見圖3。

Figure 2. The expression of MnSOD and GPx1 mRNA of the mouse pancreatic tissues in all groups±s.n=5.**Plt;0.01 vs CON group.

Figure 3. Mouse pancreatic β-cell apoptosis in all groups[insulin-staining(red)and TUNEL staining(green),×200]. A:islet from a CON mouse; B:islet from an IH mouse;C:islet from a SH mouse;D: apoptotic rate in all groups±s.n=5.**Plt;0.01 vs CON group.

討 論

目前眾多人類和動物的實驗研究證實間歇低氧或OSAHS對糖代謝產(chǎn)生負面影響，與胰島素抵抗/2型糖尿病獨立相關(guān)[2]。OSAHS病人出現(xiàn)糖代謝異常的機制是多重的，其中氧化應(yīng)激可能是其中重要的一種，即OSAHS病人胰腺損傷可能與IH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[3]。

MDA是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸、引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物；SOD為自由基清除劑，在清除自由基的同時本身被消耗。故測定MDA和SOD水平可反應(yīng)機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，間歇低氧組小鼠胰腺組織存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，MDA水平明顯增高，SOD水平顯著降低。與間歇低氧不同，持續(xù)低氧并沒有引起小鼠胰腺組織明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，其原因可能為：(1)持續(xù)低氧狀態(tài)下，胰腺組織血流灌注再分布，胰腺組織血流供應(yīng)充分[4]；(2)持續(xù)低氧增加了血液紅細胞SOD活性，增加了胰腺組織抗氧化能力[5]。而間歇低氧類似于心梗或腦中風(fēng)時的缺血再灌注損傷，產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮損傷可能引起外周胰島素抵抗增加[6]，我們的胰島素耐量實驗研究證實小鼠IH暴露后胰島素抵抗明顯增加，而持續(xù)低氧后小鼠胰島素抵抗則沒有明顯增加。氧化應(yīng)激能調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和表達[7-9]，本研究表明間歇低氧可降低小鼠抗氧化酶MnSOD 和GPx1的mRNA表達水平。有研究證實抗氧化酶表達的下降可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞凋亡的內(nèi)在機制之一[10]；另外，β細胞對氧化應(yīng)激非常敏感[11,12]，有報道表明褪黑素(松果體分泌的一種抗氧化劑)能幾乎完全逆轉(zhuǎn)β細胞的凋亡，提示氧化應(yīng)激可能是IH誘導(dǎo)β細胞凋亡的主要原因[6]，本實驗IH時β細胞的凋亡增加4倍多。

總之，IH或OSAHS時氧化應(yīng)激增加，使抗氧化酶的表達下降，進而導(dǎo)致β細胞的凋亡增加，這可能是OSAHS患者并發(fā)胰島素抵抗及2型糖尿病的病理生理機制之一。

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Apoptosisinmousepancreaticβcellsexposedtointermittenthypoxia

LI Guang1, CHAI Wen-shu1, KANG Jian2

(1DepartmentofRespiratoryDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalCollege,Jinzhou121000,China;2DepartmentofRespiratoryDiseases,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:kangjian58@163.com)

AIM: To investigate the effect of intermittent hypoxia on the apoptosis of mouse pancreatic β cells and its possible mechanism.METHODSThirty healthy male C57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups: control group, sustained hypoxia (SH)group and intermittent hypoxia (IH)group. Insulin tolerance test was performed immediately after experiment. The level of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were detected by chemical colorimetry. Real-time PCR was used to measure the mRNA expression of manganese superoxide dismutase(MnSOD) and glutathione peroxidase(GPx1). The apoptosis of pancreatic β cells was determined by the method of TUNEL.RESULTSThe levels of insulin resistance and content of MDA in the pancreatic tissue in IH group were significantly higher than those in control group and SH group (Plt;0.01). The activity of SOD and the mRNA expression of MnSOD and GPx1 in IH group were significantly lower than those in control group and SH group (Plt;0.01). The apoptotic rate of IH group was significantly elevated as compared with control group and SH group (Plt;0.01). No significant difference of all above indexes between control group and SH groups was observed (allPgt;0.05).CONCLUSIONApoptosis of pancreatic β cells induced by oxidative stress associated with IH in the pancreatic tissue may be involved in the pathogenesis of obstructive sleep apnea hyponea syndrome with insulin resistance and type 2 diabetes．

Intermittent hypoxia; Insulin resistance; β cells; Apoptosis

1000-4718(2011)04-0794-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.034

2010-10-08

2011-01-24

△ 通訊作者 Tel:024-83282532;E-mail:kangjian58@163.com