骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清中瘦素、白細(xì)胞介素6、前列腺素E2及骨組織中β2-腎上腺素受體的影響*

孫 影， 楊 麗， 呂辰鵬， 方 霽， 左 娜， 沈家珍， 張榮華，△

(暨南大學(xué) 1藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632)

骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清中瘦素、白細(xì)胞介素6、前列腺素E2及骨組織中β2-腎上腺素受體的影響*

孫 影1， 楊 麗1， 呂辰鵬1， 方 霽2， 左 娜1， 沈家珍2， 張榮華1，2△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632)

目的觀察骨碎補總黃酮對去卵巢骨質(zhì)疏松(OP)模型大鼠血清中瘦素(LEP)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)及骨組織中β2-腎上腺素受體(ADRB2)的影響。方法采用雙側(cè)卵巢切除法復(fù)制OP大鼠模型；造模12周后以雙能X線法檢測骨礦物質(zhì)密度(BMD)，確定OP模型是否復(fù)制成功；用藥12周后應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測血清中LEP、IL-6和PGE2的濃度，免疫組化法檢測大鼠骨組織中ADRB2的表達(dá)。結(jié)果造模12周后，模型組與假手術(shù)組相比，多個部位BMD顯著下降(Plt;0.01)，提示OP模型復(fù)制成功。用藥12周后模型組LEP、IL-6和PGE2較假手術(shù)組均有顯著增高(Plt;0.05)；骨碎補總黃酮組LEP和IL-6較模型組有明顯降低(Plt;0.01)，PGE2無顯著差異(Pgt;0.05)；模型組ADRB2表達(dá)與假手術(shù)組和給藥組間比較有顯著差異(Plt;0.05)，假手術(shù)組和給藥組間比較無顯著差異(Pgt;0.05)。結(jié)論去卵巢OP大鼠血清LEP、IL-6、PGE2和骨組織ADRB2表達(dá)升高；而骨碎補總黃酮能降低去卵巢OP大鼠血清中LEP、IL-6水平和骨組織ADRB2表達(dá)，抑制骨吸收，這可能是骨碎補總黃酮防治OP的作用機制之一。

骨碎補總黃酮； 瘦素； 白細(xì)胞介素6； 前列腺素E2； 受體,腎上腺素能，β2； 骨質(zhì)疏松

骨碎補具有補腎、強骨的功效，其主要活性成分骨碎補總黃酮對骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)有較好的療效[1]。本實驗通過觀察骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠OP模型血清中瘦素(leptin，LEP)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)及骨組織中β2-腎上腺素受體(β2-adrenergic receptor，ADRB2)的影響，試圖了解骨碎補總黃酮治療OP的可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物、試劑與儀器 骨碎補總黃酮(強骨膠囊，北京岐黃藥業(yè)生產(chǎn)；1 g相當(dāng)于66.7 g生藥，每粒含總黃酮1.8 g)；華美試劑盒(產(chǎn)品編號為CSB-E07967r、CSB-E04640r、CSB-E07433r)；SA1022兔IgG試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司);ADRB2多克隆兔抗鼠抗體(博士德生物技術(shù)有限公司)。TECAN酶標(biāo)儀(型號：Sunrise Remote/Touch Screen,南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)；微量有機分析專用超純水機(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；恒溫生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；CU420型電熱恒溫水箱(上海一恒科技有限公司)；MC-1180顯微鏡(廣州粵顯光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2動物 3月齡SD雌性大鼠45只(SPF級)，體重為(248.2±12.0)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(粵)2008-0002。

1.3受試環(huán)境 暨南大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心，各組動物均飼養(yǎng)于專用鼠籠內(nèi)，每籠5只，室溫調(diào)節(jié)在(24±2) ℃，自由攝食與飲水。

2方法

2.1動物分組及模型復(fù)制 經(jīng)過2周環(huán)境適應(yīng)，運用Excel函數(shù)進(jìn)行完全隨機實驗分組，將大鼠隨機分為假手術(shù)組(15只)、模型組(30只)。OP模型復(fù)制，具體操作參照文獻(xiàn)法[2，3]，造模12周后雙能X線法檢測骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density，BMD)，在確定OP模型復(fù)制成功后，將模型組隨機分為模型空白組以及骨碎補總黃酮組，每組15只。假手術(shù)組做同樣切口，找到卵巢后不切除，直接縫合傷口。

2.2藥物干預(yù)及標(biāo)本采集 模型復(fù)制成功后進(jìn)行藥物干預(yù)，每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。骨碎補總黃酮組給藥量50 mg·kg-1·d-1。空白組及模型組給予等體積的蒸餾水灌胃。藥物干預(yù)12 周后，處死動物，心臟取血，離心取血清，每份血清分裝3-4個冷凍管中，每管1-2 mL，置-80 ℃低溫冰箱保存，待用。取出大鼠左右股骨，4%多聚甲醛固定，固定好的骨組織進(jìn)行微波輻射脫鈣直至骨組織軟化，以能用針頭順利刺進(jìn)骨皮質(zhì)為宜，脫鈣成功后，恒溫冷凍機切片，組織片經(jīng)過清潔處理后直接貼片，待用。

2.3ELISA法檢測LEP、IL-6和PGE2的表達(dá) 分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，37 ℃反應(yīng)120 min。棄去液體，甩干，不洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育。溫育60 min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2 min，200 μL/well，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，37 ℃，60 min。溫育60 min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(A值)。

2.4免疫組化法檢測骨組織ADRB2的表達(dá) 脫蠟和水化：組織切片置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min；無水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；90%乙醇中浸泡5 min；80%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min；蒸餾水中浸泡5 min。蒸餾水洗3次各5 min。用3%H2O2內(nèi)源性滅活10 min，蒸餾水洗3次各5 min。胰酶修復(fù)37 ℃，10 min。PBS洗3次每次3 min。滴加5%BSA封閉液，室溫15 min，甩去多余液體。滴加Ⅰ抗(稀釋100倍)，4 ℃過夜，PBS洗3次每次2 min。滴加生物素化Ⅱ抗, 37 ℃ 20 min，PBS洗3次每次2 min。滴加鏈霉素化親和素試劑，37 ℃ 20 min，PBS洗4次，每次5 min。DAB顯色10 min(鏡下掌握顯色程度)。蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染1 min，Na2HPO4飽和。脫水、透明、封片、免疫組化陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按照參考文獻(xiàn)[4]制定，利用Leica正立電動顯微鏡，每組隨機抽取5張骨組織切片，400倍的高倍鏡下每個組織片隨機選取5個能代表該組織片特點的視野，觀察大鼠骨組織ADRB2的表達(dá)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1BMD檢測結(jié)果

造模12周后模型組和假手術(shù)組隨機抽取樣本，雙能X線法檢測BMD，結(jié)果見表1。模型組與假手術(shù)組相比，多個部位BMD明顯下降，差異顯著(Plt;0.01)，提示模型組大鼠骨量顯著丟失，造模成功。

表1 造模12周后模型組與假手術(shù)組大鼠的BMD

2各組大鼠血清中LEP、IL-6和PGE2的濃度

結(jié)果見表2，藥物干預(yù)12 周后模型組LEP含量較假手術(shù)組明顯增高(Plt;0.01)，骨碎補總黃酮組較模型組明顯降低(Plt;0.01)；模型組IL-6含量較假手術(shù)組明顯增高(Plt;0.01)，骨碎補總黃酮組較模型組明顯降低(Plt;0.01)；模型組PGE2含量較假手術(shù)組有明顯增高(Plt;0.05)。骨碎補總黃酮組PGE2含量低于模型組，但無顯著差異(Pgt;0.05)。

表2 藥物干預(yù)12 周后各組大鼠血清LEP、IL-6和PGE2的水平

3各組大鼠骨組織ADRB2的表達(dá)

藥物干預(yù)12周后檢測各組大鼠骨組織ADRB2的表達(dá)，結(jié)果見圖1和表3。假手術(shù)組ADRB2表達(dá)明顯低于模型組，差異顯著(Plt;0.05)；給藥組ADRB2表達(dá)明顯低于模型組，差異顯著(Plt;0.05)，與假手術(shù)組比較無顯著差異(Pgt;0.05)。

Figure 1. ADRB2 expression in bone of rats by immnunohistochemistry(×400).A:negative group;B:sham group;C:model group;D:treatment group.

表3 藥物干預(yù)12 周后各組大鼠骨組織ADRB2的陽性表達(dá)數(shù)

討 論

OP是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性疾病。OP的發(fā)病機制復(fù)雜，影響因素很多[5]，近期研究發(fā)現(xiàn)骨組織內(nèi)神經(jīng)功能異常對骨代謝失衡及OP的發(fā)病有重要影響[6]。骨組織不僅能通過神經(jīng)骨骼信號通路調(diào)節(jié)骨骼系統(tǒng)微循環(huán)營養(yǎng)環(huán)境，還直接通過交感神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)。其中神經(jīng)遞質(zhì)LEP介導(dǎo)的交感神經(jīng)活動能抑制骨組織形成[6]，LEP通過交感神經(jīng)作用于骨組織上的效應(yīng)器是成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)，作用受體是ADRB2，而ADRB2被激活后可促進(jìn)IL-6和PGE2的表達(dá)[7]，進(jìn)而刺激破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)生成和分化，從而導(dǎo)致骨量的下降。

本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠血清中LEP、IL-6和PGE2水平均顯著高于假手術(shù)組(Plt;0.05)，說明去卵巢大鼠OP發(fā)生過程中確實存在血清中LEP、IL-6和PGE2水平升高現(xiàn)象。

血清中LEP水平可限制骨高轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的骨丟失，從而對OP發(fā)生保護作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮組LEP含量明顯低于模型組(Plt;0.01)，接近假手術(shù)組。說明骨碎補總黃酮能糾正大鼠血清中LEP的上升；骨碎補總黃酮組ADRB2表達(dá)明顯低于模型組(Plt;0.05)，說明骨碎補總黃酮能糾正大鼠骨細(xì)胞ADRB2的高表達(dá)。IL-6是促進(jìn)骨組織吸收的重要細(xì)胞因子，OB和OC膜上都存在IL-6受體，交感神經(jīng)可通過IL-6等刺激OB和間質(zhì)細(xì)胞上分泌核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)影響骨吸收[8,9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮組IL-6含量明顯低于模型組(Plt;0.01)，與假手術(shù)組無差別，其變化趨勢與LEP相同。由此推測骨碎補總黃酮通過抑制LEP的表達(dá)，抑制其下游因子IL-6的表達(dá)。PGE2在維持OB與OC的平衡中起著重要作用，它通過對破骨前體細(xì)胞表達(dá)的RANKL進(jìn)行調(diào)控，刺激OC分化，抑制其凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮組PGE2含量與模型組相比無顯著差異(Pgt;0.05)，但此結(jié)果尚不能說明骨碎補總黃酮治療OP與PGE2完全無關(guān)，其與去卵巢大鼠血清PGE2的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，去卵巢OP大鼠血清LEP、IL-6、PGE2和骨組織ADRB2表達(dá)升高，而骨碎補總黃酮能降低去卵巢OP大鼠血清中LEP、IL-6水平和骨組織ADRB2表達(dá)，抑制骨吸收，這可能是骨碎補總黃酮防治OP的作用機制之一。

[1] 王和鳴，葛繼榮，田金洲，等. 強骨膠囊治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥臨床試驗[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2004，15(4): 284-287.

[2] Devlin H, Ferguson MW. Compositional changes in rat femur following ovariectomy[J]. Acta Anat (Basel), 1989, 136(1): 38-41.

[3] Kalu DN, Hardin RR, Cockerham R. Evaluation of the pathogenesis of skeletal changes in ovariectomized rats[J]. Endocrinology, 1984, 115(2): 507-512.

[4] 許良中，楊文濤. 免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

[5] 楊 麗，張榮華，蔡 宇，等.去卵巢對SD大鼠MSCs生物學(xué)特性的影響[J].中國病理生理雜志，2010，26(7)：1249-1254.

[6] Spencer GJ, Hitchcock IS,Genever PG. Emerging neuroskeletal signalling pathways: a review[J]. FEBS Lett, 2004, 559(1-3): 6-12.

[7] Ducy P,Amling M,Takeda S, et al. Leptin inhibits bone formation through a hypothalamic relay: a central control of bone mass[J]. Cell, 2000, 100(2): 197-207.

[8] Takeuchi T, Tsuboi T, Arai M, et al. Adrenergic stimulation of osteoclas-togenesis mediated by expression of osteoblast differentiation factor in MC373-E1 osteoblast-like cells[J]. Biochem Pharmacol, 2001, 61(5): 579-586.

[9] Lee SK,Gardner AE,Kalinowski JF, et al. RANKL-stimulated osteoclast-like cell formationinvitrois partially dependent on endogenous interleukin-1 production[J]. Bone, 2005, 38(5): 678-685.

Effectsofdrynariatotalflavonoidsonserumlevelsofleptin,interleukin6,prostaglandinE2andexpressionofboneβ2-adrenergicreceptorinovariectomizedosteoporosisrats

SUN Ying1, YANG Li1, Lü Chen-peng1, FANG Ji2, ZUO Na1, SHEN Jia-zhen2, ZHANG Rong-hua1, 2

(1DepartmentofChineseMateriaMedica,PharmacyCollege,2DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of drynaria total flavonoids on serum levels of leptin (LEP), interleukin 6(IL-6), prostaglandin E2(PGE2) and the expression of bone β2-adrenergic receptor (ADRB2) in a rat model of ovariectomized osteoporosis(OP).METHODSThe osteoporosis model was established by ovariectomy. Twelve weeks after modeling,bone mineral density (BMD) was determined by dual-energy X-ray absorptiometry to verify successful modeling.Enzyme-linked immunosorbent assay was applied to detect the concentrations of LEP, IL-6 and PGE2in serum. The expression of ADRB2 was determined by immunohistochemical technique.RESULTSCompared with sham group,BMD of the rats in model group significantly decreased in multiple regions 12 weeks after modeling(Plt;0.01). The serum levels of LEP, IL-6 and PGE2in model group were significantly higher than those in sham group(Plt;0.05). The levels of LEP, IL-6 and PGE2in drynaria total flavonoids group were significantly lower than those in model group(Plt;0.01). No significant difference of PGE2between these 2 groups was observed. The ADRB2 expression in sham group and treatment group was significantly different from that in model group, and no significant difference between sham group and treatment group was found.CONCLUSIONThe serum levels of LEP, IL-6 and PGE2and the expression of bone ADRB2 increased in OP rats.Drynaria total flavonoids reduce the production of LEP, IL-6 and the expression of ADRB2, and suppress the bone absorption, which may be one of the mechanisms in treating OP.

Drynaria total flavonoids; Leptin; Interleukin 6; Prostaglandin E2; Receptors,adrenergic,beta-2; Osteoporosis

1000-4718(2011)04-0755-04

R361+2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.025

2010-12-09

2011-01-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30772885)

△通訊作者Tel：020-85228578；E-mail：tzrh@jnu.edu.cn