房顫患者血清對心肌成纖維細(xì)胞趨化運(yùn)動的影響*

段卡丹, 李裕舒△， 史曉婧

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管病研究所, 湖北 武漢 430022; 2偃師市人民醫(yī)院， 河南 偃師 471900)

房顫患者血清對心肌成纖維細(xì)胞趨化運(yùn)動的影響*

段卡丹1, 李裕舒1△， 史曉婧2

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管病研究所, 湖北 武漢 430022;2偃師市人民醫(yī)院， 河南 偃師 471900)

目的研究心肌成纖維細(xì)胞的運(yùn)動特性，以及房顫與非房顫患者血清對成纖維細(xì)胞趨化運(yùn)動誘導(dǎo)能力的差異。方法用胰酶和膠原酶消化、差速貼壁法培養(yǎng)新生SD大鼠的心肌成纖維細(xì)胞，取3-4代采用Transwell裝置檢測房顫組血清與非房顫組血清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞運(yùn)動的能力差異。結(jié)果在各組血清的趨化誘導(dǎo)作用下，與對照組相比，遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯增多。其中持續(xù)性房顫組最多，非房顫房性心律失常組明顯高于陣發(fā)性房顫組，對照組細(xì)胞數(shù)最少，各組比較均具有顯著差異。Logistic回歸分析表明，遷移至濾膜下的細(xì)胞數(shù)與左房直徑以及房顫有相關(guān)性。結(jié)論(1)各組血清的趨化誘導(dǎo)能力高于對照組，不同組間的差異說明心房纖維化是一個慢性、隱匿、遷延的過程。以修復(fù)為目的的成纖維細(xì)胞遷移浸潤數(shù)量間接反映了心肌損傷的存在、范圍和程度。(2)遷移浸潤的細(xì)胞數(shù)變化先于左房直徑變化，提示房顫和左房直徑增大的正相關(guān)關(guān)系可能并非直接的因果關(guān)系，心房肌損傷后的纖維化可能參與其中。

心房顫動; 心肌成纖維細(xì)胞; 趨化作用

心房纖顫(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，是臨床上常見的心律失常，成人中發(fā)生率接近2%，并且它隨著年齡的增長而增加，超過65歲的人群中發(fā)病率為5.9%[1]。房顫因回心血量減少而誘發(fā)或加重心功能衰竭、因長時(shí)間過速的心室率致心肌病、因心房同步收縮消失而致左心房血栓形成導(dǎo)致血栓栓塞。研究顯示，房顫患者心血管疾病的病死率增加2倍，腦卒中的發(fā)病率增加4倍；房顫是心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的主要原因[2]。多項(xiàng)研究[3-6]顯示房顫患病率的增長與冠心病、高血壓、慢性心力衰竭、風(fēng)心病等慢性病發(fā)病率的增長相關(guān)，Smit等[7]心臟研究顯示：高齡、高血壓、冠心病、心衰和瓣膜病都是與房顫相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

房顫的發(fā)生機(jī)制仍不十分明確，既往房顫的研究主要集中在心肌細(xì)胞本身的變化上，對成纖維細(xì)胞的作用知之甚少。隨著對心房組織進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，心房纖維化是一個與房顫密切相關(guān)的組織重構(gòu)現(xiàn)象，它是心肌損傷和修復(fù)失衡的結(jié)果。心房成纖維細(xì)胞是心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原合成和聚集的主要細(xì)胞類型，心房纖維化時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞不僅數(shù)量增多，其合成和分泌膠原也會明顯增多。成纖維細(xì)胞在心肌纖維化過程中除膠原蛋白產(chǎn)物產(chǎn)生和播散作用外，是否存在遷移運(yùn)動過程以及對心房肌間的結(jié)構(gòu)重構(gòu)產(chǎn)生影響迄今尚未見報(bào)道。本文旨在研究房顫與非房顫組血清對成纖維細(xì)胞遷移運(yùn)動的誘導(dǎo)能力，為成纖維細(xì)胞在房顫過程中遷移運(yùn)動對心房肌的分割和纖維化作用尋求實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM高糖干粉培養(yǎng)基、新生牛血清、胰酶-EDTA(Gibco)，膠原酶B型(Roche)，胰蛋白酶1∶250(Americo)，Transwell購自Corning，Gimsa染劑購自南京建成公司,新生SD大鼠(武漢大學(xué)動物中心)。

2方法

2.1病例選擇 實(shí)驗(yàn)對象共分為4組。其中房性心律失常病人共56例，選自2009年6月-2010年3月在武漢協(xié)和醫(yī)院住院期間被診斷為房性心律失常的患者。其中非房顫房性心律失常組(non-AF atrial arrhythmia,AA)共18例；陣發(fā)性房顫組(paroxysmal atrial fibrillation，Paro-AF)(發(fā)作時(shí)間≤7 d)共19例；持續(xù)性房顫組(persistent atrial fibrillation，per-AF)(發(fā)作時(shí)間gt;7 d)共20例；對照組為年齡、性別和相關(guān)疾病匹配的竇性心律者共16例?；颊呔?jīng)病史、體格檢查、心電圖、心臟彩超、動態(tài)心電圖等診斷證實(shí)。近3個月內(nèi)有心梗病史、急性冠脈綜合征、心肌病或心肌炎；近2個月內(nèi)有手術(shù)外傷史或感染史；腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病；肝、腎功能不全患者；近期正在服用抗炎藥物或激素替代治療患者等排除在外。各組年齡、性別、相關(guān)疾病無顯著差異，見表1。

2.2標(biāo)本采集 入選患者均晨起空腹，靜臥30 min后，采肘靜脈血4 mL，室溫下充分凝固后，3 000 r/min離心20 min，離心后取上清，-60℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下開胸取出SD大鼠乳鼠(1-3 d)心臟，立即置入預(yù)冷的PBS中，洗凈殘血，剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎片，棄去PBS，加入0.1%膠原酶B、0.25%胰酶及PBS混合液，于37 ℃水浴中分次振蕩消化，第1次消化10 min，棄上清，以后每次5 min，收集上清用等體積20%新生牛血清的培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min后所得的細(xì)胞用20%新生牛血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，種于50 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)75 min后，棄去上清獲得成纖維細(xì)胞。取3-4代用于實(shí)驗(yàn)。

表1 臨床資料

2.4細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn) 采用Transwell法，Transwell小室濾膜為孔徑8 μm的聚碳酸酯微孔濾膜。取第3或4 代心肌成纖維細(xì)胞， 0.1%BSA饑餓過夜，消化重懸調(diào)整細(xì)胞密度為2×108cells/L，取0.1mL加入上室；下室中分別加入0.6 mL濃度為20%的病人血清作為化學(xué)趨化物，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，18 h后取出濾膜，4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗，棉簽拭去上室表面內(nèi)殘存細(xì)胞，Giemsa染色。顯微鏡下隨機(jī)取5個視野(×200)細(xì)胞數(shù)取平均值(個/HP)，每組血清均重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1各組血清對心肌成纖維細(xì)胞趨化運(yùn)動及細(xì)胞數(shù)影響

在各組血清的趨化作用下，持續(xù)性及陣發(fā)性房顫組、非房顫房性心律失常組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)分別為105.00±10.36、68.00±12.82、89.00±7.09，而對照組為60.00±11.87，4組間有明顯差異(Plt;0.01)。其中持續(xù)性房顫組血清對成纖維細(xì)胞的趨化作用最明顯，非房顫房性心律失常組較陣發(fā)性房顫組明顯增加，對照組最弱，各組相比均有顯著差異(Plt;0.05),見表2、圖1；在房顫組(持續(xù)性和陣發(fā)性)血清的誘導(dǎo)下，遷移至濾膜外的細(xì)胞數(shù)為86.00±22.33，與非房顫房性心律失常組和對照組比較，3組間有明顯差異(Plt;0.01)，房顫組與對照組相比差異明顯(Plt;0.05)，而房顫組與非房顫房性心律失常組比較兩者差異無顯著。

Figure 1. The change of cardiac fibroblast chemotaxis in each group (Giemsa staining)

2各組左房直徑

患者左房直徑有明顯差異，其中持續(xù)性房顫組左房直徑為(5.40±0.63)cm，陣發(fā)性房顫組、非房顫房性心律失常組、對照組分別為(4.70±0.79)cm、(3.80±0.56)cm、(4.00±0.76)cm。持續(xù)性房顫組左房最大，陣發(fā)性房顫組次之，與其它各組比較顯著差異(Plt;0.05)；非房顫房性心律失常組與對照組比較無顯著差異，見表2。房顫組(持續(xù)性和陣發(fā)性)左房直徑為(5.10±0.60)cm，與其余兩組比較，差異均具有顯著(Plt;0.05)。

表2 各組左房直徑及細(xì)胞數(shù)

3多元Logistic回歸分析

將性別、高血壓、心衰、瓣膜病、冠心病、糖尿病、房顫以及連續(xù)型變量(年齡、左房直徑、細(xì)胞數(shù))等級化后納入Logistic模型，其中房顫(OR=0.260，95%CI：0.069-0.990，Plt;0.05)、左房直徑(OR=0.565，95%CI：0.323-0.987，Plt;0.05)與細(xì)胞數(shù)有相關(guān)性。

討 論

我們的前期研究結(jié)果證實(shí)了房顫血清具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞在試驗(yàn)培養(yǎng)過程中增殖的重要作用[8]，本實(shí)驗(yàn)再次顯示房顫血清對成纖維細(xì)胞還有誘導(dǎo)遷移作用。房顫和心房纖維化相伴行的現(xiàn)象已為公認(rèn)病理結(jié)果。心肌成纖維細(xì)胞是構(gòu)成心臟的主要細(xì)胞類型，占心肌細(xì)胞數(shù)量的70%[9]。有證據(jù)顯示成纖維細(xì)胞在心臟的手術(shù)修復(fù)和心臟的重構(gòu)中起著改變電生理和炎癥反應(yīng)等方面重要作用[10]。成纖維細(xì)胞無論從鄰近存活心肌轉(zhuǎn)化而成，抑或因纖維細(xì)胞激活、遷移、浸潤而至，均具有在壞死區(qū)域行使修復(fù)的作用，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的恰當(dāng)與否則成為纖維化程度的主要差異。因而，成纖維細(xì)胞的遷移和增殖是心肌纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究各組遷移的成纖維細(xì)胞數(shù)差異說明各組血清對心肌成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)作用具有差異，提示誘導(dǎo)遷移過程不是簡單的單次誘導(dǎo)行為，而是一個反復(fù)、緩慢、遷延、隱匿的過程，是炎癥反應(yīng)的一部分。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為房顫受心房大小的影響，甚至有研究認(rèn)為左房直徑已成為房顫的重要預(yù)測因子[11-15]。本研究結(jié)果中房顫和左房大小的臨床統(tǒng)計(jì)均支持房顫與左心房大小有相關(guān)性，但本實(shí)驗(yàn)中遷徙細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示非房顫房性心律失常組較陣發(fā)性房顫組明顯增加，與左房直徑卻呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示細(xì)胞數(shù)的變化明顯先于左房直徑的變化，在心房直徑尚未發(fā)生改變前，損傷與修復(fù)就已經(jīng)存在了，間接表明房顫和左心房增大的變化可能均為心肌損傷變化的結(jié)果。所以，多元Logistic 回歸分析顯示遷移的細(xì)胞數(shù)與左房直徑呈正相關(guān)關(guān)系可能受到心肌損傷因素的影響，兩者間可能不是直接因果關(guān)系。遷移浸潤的細(xì)胞數(shù)是間接反映心肌損傷存在的一項(xiàng)指標(biāo)，并與損傷的程度和范圍密切相關(guān)。非房顫房性心律失常組與對照組比較，心房大小無明顯差異，其血清對成纖維細(xì)胞趨化能力的誘導(dǎo)作用明顯增高(Plt;0.05)，表明此時(shí)心肌損傷已經(jīng)存在，有明顯的細(xì)胞浸潤，心肌修復(fù)已在進(jìn)行；陣發(fā)性房顫已有左房形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，但細(xì)胞數(shù)介于非房顫房性心律失常組和對照組之間，說明此階段雖有損傷存在，但處于損傷的相對靜止期，此階段是一個可逆的穩(wěn)定階段，若得到恰當(dāng)?shù)母深A(yù)是可逆或終止的，該結(jié)果成為陣發(fā)性房顫值得射頻消融的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)之一。持續(xù)性房顫組遷移細(xì)胞最多，預(yù)示損傷和修復(fù)的范圍廣，纖維化進(jìn)程加快，纖維化過程處于較高活動水平。本實(shí)驗(yàn)中做了2例永久性房顫患者，遷移的細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，說明心房肌損傷修復(fù)已處于終末階段，進(jìn)一步的心肌損傷和纖維修復(fù)的空間甚微，不足以成有效誘導(dǎo)纖維細(xì)胞。盡管該組病例數(shù)很少，卻給我們研究房顫纖維化進(jìn)程提供了線索。非房顫房性心律失常組遷移細(xì)胞數(shù)與不同房顫類型之間的差異。充分說明纖維化過程遷延或反復(fù)進(jìn)行。在一定時(shí)期內(nèi)，纖維化可緩慢持續(xù)存在，也可間歇發(fā)生。

本研究納入的房性心律失常包括房性早搏、各種不同類型的房速、心房撲動等一些容易被忽視但值得關(guān)注的類型。結(jié)果同樣顯示該類病人血清已經(jīng)具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移的作用，提示這些患者已經(jīng)存在隱襲的心肌損傷和修復(fù)過程，以及纖維化的形成。從另一個角度提示自然發(fā)生的非房顫房性心律失?？梢韵蜿嚢l(fā)性房顫發(fā)展最終演變成為持續(xù)性房顫的緩慢過程，及早發(fā)現(xiàn)那些心肌損傷和對其進(jìn)行有針對性的干預(yù)尤為重要。

心臟重構(gòu)中成纖維細(xì)胞是起決定作用的細(xì)胞。纖維化結(jié)果影響著心肌細(xì)胞的電生理協(xié)調(diào)和機(jī)械收縮功能，影響著組織的粘黏、骨架運(yùn)動和伸縮功能。進(jìn)一步觀察誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞運(yùn)動行為的因素有利于揭示心肌纖維化的細(xì)胞因子機(jī)制，為房顫心房纖維化的治療提供新的途徑。而對成纖維細(xì)胞的運(yùn)動機(jī)制探討和調(diào)控將會成為預(yù)防房顫的一個重要環(huán)節(jié)。

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Effectsofserumfrompatientswithatrialfibrillationonchemotaxisofcardiacfibroblasts

DUAN Ka-dan1, LI Yu-shu1, SHI Xiao-jing2

(1InstituteofCardiovascularDiseases,UnionHospitalofTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China;2YanshiMunicipalPeople’sHospital,Yanshi471900,China.E-mail:Lyshu1@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effects of the serum from the patients with atrial fibrillation (AF) on the chemotaxis of rat cardiac fibroblasts.METHODSCardiac fibroblasts were isolated from the ventricles of neonatal Sprague-Dawley rats and primarily cultured with digestion and differential adhesion. The cells in 3 to 4 passages were used for Transwell chamber assay to determine the chemotatic effects of the sera.RESULTSCompared with control group, the cells that migrated through the polycarbonate membrane were obviously increased in AF group. The strongest chemotaxis was induced by the serum from the patients with persistent atrial fibrillation(pers-AF).The number of migrated cells in non-AF atrial arrhythmia(AA) group was higher than that in paroxysmal atrial fibrillation(paro-AF) group, and that in control group was the lowest. The results of multiple Logistic regression analysis showed that the migrated cells were related to AF and left atrial diameter.CONCLUSIONThe chemotactic effect of AF serum is obviously higher than that of control serum. The differences of AF sera among groups show that myocardial fibrosis is a chronic, insidious and delayed process. The migration and infiltration of cardiac fibroblasts indirectly reflect the presence, severity and extent of the myocardial damage. The changes of migrated cells precede the changes of left atrial diameter, indicating that the cause of fibrosis is more important, and the positive correlation between AF and left atrial diameter may not be the direct causality.

Atrial fibrillation; Cardiac fibroblasts; Chemotaxis

1000-4718(2011)04-0662-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.008

2010-10-22

2011-02-18

湖北省科技廳基金資助項(xiàng)目(No.2009CDB070)

△通訊作者 Tel：027-85726423;E-mail:Lyshu1@yahoo.com.cn