轉(zhuǎn)Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究進(jìn)展

邢福國 劉陽 喬文靜

摘要：總結(jié)了Ｂｔ殺蟲蛋白的特性、轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物毒素蛋白在土壤中的殘留和積累以及對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，闡明了轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物毒素蛋白在土壤中的降解與影響因素，并提出應(yīng)積極開展轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物秸稈的降解研究，在降解秸稈的同時降解其中的Ｂｔ毒素蛋白。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物；毒素蛋白；土壤；降解

中圖分類號：Ｑ７８８；Ｓ１５８．４ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）16－3244-06

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｂｔ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ Ｃｒｏｐｓ

ＸＩＮＧ Ｆｕ－ｇｕｏ，ＬＩＵ Ｙａｎｇ，ＱＩＡＯ Ｗｅｎ－ｊｉｎｇ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏ－ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｂｔ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｓｏｉｌ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ｏｆ ｔｏｘｉｎｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ ｏｎ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ were ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ of Bt Protein in soil ａｎｄ its ｉｍｐａｃｔing factors ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． It was suggested that ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ ｓｔａｌｋｓ should be investigated， ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ Ｂｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ ｗｈｉｌｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ ｓｔａｌｋｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ； ｔｏｘｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｓｏｉｌ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ

自１９８３年轉(zhuǎn)基因作物問世以來，轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅猛，全球種植面積從１９９６年的１７０萬ｈｍ２增加到２００９年的１．３４億ｈｍ２，翻了近８０倍，累計(jì)達(dá)１０億ｈｍ２，截至２００９年累計(jì)經(jīng)濟(jì)效益達(dá)５１９億美元。２００９年共有２５個國家的１ ４００萬農(nóng)民種植了轉(zhuǎn)基因作物，其中，美國是世界上最大的轉(zhuǎn)基因作物種植國，占全世界的４８％。２００９年，轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆仍然是主要的轉(zhuǎn)基因作物，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的５２％，其次是轉(zhuǎn)基因玉米（占３１％）、轉(zhuǎn)基因棉花（占１２％）和轉(zhuǎn)基因油菜（占５％）。２００９年發(fā)展中國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占世界的４６％，中國居世界第六位。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織（ＩＳＡＡＡ）預(yù)測：２０１５年，世界將有４０個國家的

２ ０００萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積將擴(kuò)大到２億ｈｍ２ ［１］。轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物是全球商品化程度最快的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，目前進(jìn)行商業(yè)化種植的有轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米（Ｂｔ１１、Ｍｏｎ８１０、Eｖｅｎｔ１７６等）、棉花、馬鈴薯和楊樹等。但轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物大規(guī)模種植的潛在生態(tài)風(fēng)險是許多科學(xué)家爭論的焦點(diǎn)。研究表明，Ｂｔ殺蟲晶體蛋白可以通過轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物根系分泌物或作物殘留等形式進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，并且在土壤和環(huán)境中比較穩(wěn)定，經(jīng)過較長的時間后仍具有很高的活性，因此可能會對土壤微生物類群、土壤多樣性以及周圍生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響。本研究綜述了轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物毒素蛋白的降解特性研究進(jìn)展，旨在為開展Ｂｔ殺蟲晶體蛋白的降解研究工作和系統(tǒng)評估轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物的生態(tài)風(fēng)險提供參考數(shù)據(jù)。

１Ｂｔ殺蟲蛋白

１．１Ｂｔ殺蟲蛋白的殺蟲機(jī)制

Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）是一種革蘭氏陽性需氧型芽孢桿菌，１９０１年Ｉｓｈｉｗａｔａ首先在染病的蠶蛾中發(fā)現(xiàn)這種芽孢桿菌，但是沒有保存下來。１９０９年，Ｂｅｒｌｉｎｅｒ從德國蘇云金省的地中海粉螟上重新分離到Ｂｔ，并正式定名為蘇云金芽孢桿菌［２］。蘇云金芽孢桿菌在其芽孢形成過程中，能產(chǎn)生一種殺蟲晶體蛋白（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｂｔ的毒素可分為內(nèi)毒素和外毒素。外毒素指蘇云金桿菌在生命活動過程中排出體外的代謝物，包括α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素、不穩(wěn)定外毒素和水溶性外毒素等。內(nèi)毒素又稱δ－內(nèi)毒素、晶體毒素或殺蟲晶體蛋白。其中用于轉(zhuǎn)基因植物的主要是δ－內(nèi)毒素，δ－內(nèi)毒素被敏感昆蟲幼蟲取食后，在其消化道內(nèi)消化酶的作用下，蛋白被水解釋放出Ｍｒ約６０×１０３～７０×１０３的活性毒蛋白分子（Ｔｏｘｉｎ），毒蛋白與昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，并發(fā)生作用而使細(xì)胞膜穿孔。消化道細(xì)胞內(nèi)的離子濃度和滲透壓平衡遭破壞，使上皮細(xì)胞裂解，并導(dǎo)致昆蟲死亡［３－８］。

１．２Ｂｔ殺蟲蛋白的應(yīng)用

１９７８年，Ｓｔａｈｌｙ等［９］確定了Ｂｔ殺蟲蛋白基因的位置和可操作性。此后，各國科學(xué)家紛紛將Ｂｔ殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入其他微生物，構(gòu)建或改良可高效產(chǎn)生Ｂｔ殺蟲晶體蛋白的工程菌株；或?qū)⑵涓脑旌筠D(zhuǎn)入植物體，以期獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物。１９８７年，比利時的Ｖａｅｃｋ等［１０］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將完整的Ｃｒｙ１Ａｂ基因和３端缺失后僅保留５端編碼毒蛋白核心區(qū)的不同長度的Ｃｒｙ１Ａｂ基因?qū)霟煵荩@得了第一例轉(zhuǎn)Ｂｔ基因的植物，同年還有３個實(shí)驗(yàn)室也報道了轉(zhuǎn)Ｂｔ基因的煙草或番茄［４，１０，１１］，但這些轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性都很弱，難以檢測出ｍＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄，Ｂｔ殺蟲蛋白的表達(dá)量很低，主要原因是未改造的Ｂｔ基因具有原核性質(zhì)不能在真核生物中高效表達(dá)。因此，為了提高Ｂｔ基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，科學(xué)家們紛紛對Ｂｔ基因進(jìn)行改造或人工合成，將Ｂｔ基因的不穩(wěn)定序列換成植物偏愛的密碼子。Ｐｅｒｌａｋ等［１２］在不改變Ｂｔ殺蟲蛋白氨基酸序列的前提下，將ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＡｃ基因的密碼子進(jìn)行改造，使這兩個基因在轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)水平提高了近１００倍，Ｂｔ殺蟲蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的０．０５％～０．１0％，抗蟲功效明顯增強(qiáng)。除了對Ｂｔ基因的密碼子進(jìn)行改造外，還可以通過使用組織特異性啟動子或強(qiáng)啟動子來提高Ｂｔ基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，從而達(dá)到抗蟲的目的。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來科學(xué)家們開始嘗試用復(fù)合的具有非競爭性結(jié)合關(guān)系的Ｂｔ基因來轉(zhuǎn)化植物，以獲得對多種害蟲都能產(chǎn)生抗性的轉(zhuǎn)基因植物，Ｓａｌｍ等［１３］用分別屬于ＣｒｙＩＡｂ和ＣｒｙＩＡｃ的活性片段構(gòu)建了一個融合基因，并將其導(dǎo)入煙草和番茄，得到了對甜菜夜蛾、煙芽夜蛾、煙草夜蛾都有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。

１．３國內(nèi)轉(zhuǎn)Ｂｔ基因植物研究現(xiàn)狀

國內(nèi)有關(guān)轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物的研究雖然起步較晚，但進(jìn)展很快。１９９２年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所專家，按照高等植物偏愛密碼子的原則，在保持殺蟲蛋白活性中心與結(jié)構(gòu)的前提下，人工全序合成了Ｃｒｙ１Ａ基因，并與江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院合作采用花粉管通道途徑將人工全序合成的Ｂｔ基因?qū)朊藁?，獲得高抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)Ｂｔ抗蟲棉花［14，１５］，使我國成為繼美國之后獲得擁有自主知識產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的第二個國家。此外，中國科學(xué)院微生物所、上海植物生理研究所等單位也合成及部分改造了Ｃｒｙ１Ａ基因并導(dǎo)入煙草、甘藍(lán)和大豆，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株［１６］。丁群星等［１７］用子房注射法，將經(jīng)修飾后Ｃｒｙ１Ａｃ基因?qū)胗衩祝褂衩酌钠骄劳雎蔬_(dá)８６．６６％。另外，我國科學(xué)家對轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻的研究也較多，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位相繼都獲得了高抗蟲的轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻，并已進(jìn)行環(huán)境釋放試驗(yàn)。但是，迄今為止我國只有轉(zhuǎn)Ｂｔ基因的抗蟲棉得到了商品化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因抗蟲玉米、水稻等糧食作物大部分還處于安全評價階段。２００９年１１月２７日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)ｃｒｙ１Ａｂ／ｃｒｙ１Ａｃ基因抗蟲水稻華恢１號和Ｂｔ汕優(yōu)６３獲得了農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，使轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻向商業(yè)化應(yīng)用邁出了實(shí)質(zhì)性的一步。２００８年，科技部、農(nóng)業(yè)部、財政部等部門聯(lián)合啟動了“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)”，專項(xiàng)實(shí)施的目標(biāo)是獲得一批具有重要應(yīng)用價值和自主知識產(chǎn)權(quán)的基因，培育一批抗病蟲、抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效的重大轉(zhuǎn)基因生物新品種。專項(xiàng)的實(shí)施必將提高農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究和產(chǎn)業(yè)化整體水平，加快我國轉(zhuǎn)基因作物新品種培育和商業(yè)化種植的步伐，為我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供強(qiáng)有力的科技支撐。

２轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響

轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物的Ｂｔ殺蟲蛋白可以通過根系分泌、殘茬分解、秸稈還田以及花粉飄落等進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，并快速緊密結(jié)合于土壤活性顆粒的表面，從而避免了被降解。研究表明，這些Ｂｔ殺蟲蛋白能夠在土壤中存在一段較長的時間，并且具有一定的活性，有可能對土壤的生態(tài)系統(tǒng)造成一定的影響。因此，最近幾年轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響受到人們的廣泛關(guān)注，成為轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物安全的研究熱點(diǎn)之一。２０００年美國ＥＰＡ將轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響列為轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物風(fēng)險評價的重要組成部分。

２．１轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中的殘留和積累

Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中與土壤顆粒緊密結(jié)合，很難降解，并持續(xù)產(chǎn)生毒性［１８］。１９９６年，Ｐａｌｍ等［１９］將轉(zhuǎn)Ｂｔ基因抗蟲棉的枝葉埋入５種不同微生態(tài)系統(tǒng)土壤中，１４０ ｄ后，在其中的３種土壤中仍能檢測到Ｂｔ殺蟲蛋白，其含量分別為初始濃度的３％、１６％和３５％。１９９７年，Ｊａｍｅｓ等［２０］研究證實(shí)Ｂｔ殺蟲蛋白可通過枯枝落葉而殘留在土壤中，并進(jìn)一步證明Ｂｔ殺蟲蛋白可以與土壤黏粒結(jié)合，使其毒性難以降解，最長可以持續(xù)２～３個月。Ｓａｘｅｎａ等［２１］報道，轉(zhuǎn)基因玉米Ｂｔ毒素蛋白通過根系分泌和殘體降解釋放到土壤中，并在土壤中殘留最長可達(dá)３５０ ｄ，Ｓａｘｅｎａ等還研究了殘留于土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白的毒性，結(jié)果表明食用轉(zhuǎn)Ｂｔ玉米分泌物的幼蟲停止進(jìn)食，５ ｄ后死亡率高達(dá)９５％～１００％，而對照組玉米螟則未有死亡，這表明轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物根系分泌物具有較強(qiáng)的Ｂｔ殺蟲蛋白活性。雖然，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物分泌的Ｂｔ殺蟲蛋白具有較強(qiáng)的殺蟲活性，并能夠在土壤中殘留一段較長的時間，但是Ｄｅｅｐａｋ等［２２］研究表明，這些殘留在土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白不會被下一季作物吸收。因此，這些殘留在土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白并不會對下一季作物的抗蟲活性產(chǎn)生影響。但是，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)相對簡單，穩(wěn)定性差，對干擾較敏感，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物的大面積種植導(dǎo)致的大量Ｂｔ殺蟲蛋白進(jìn)入土壤，可能會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生較大的影響［２３］。

２．２轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物對土壤微生物區(qū)系的影響

任馨等［２４］在實(shí)驗(yàn)室條件下，比較了克螟稻Ｂｔ基因表達(dá)最高期秸稈和同一時期親本稻秸稈的添加對淹水土壤可培養(yǎng)厭氧細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌群落組成的影響。結(jié)果表明，與親本對照相比，培養(yǎng)初期克螟稻秸稈的添加對淹水土壤厭氧發(fā)酵性細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌的數(shù)量產(chǎn)生了顯著性影響，但培養(yǎng)后期這種顯著性差異基本消失。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ指紋圖譜和主成分分析（ＰＣＡ）結(jié)果表明，兩種秸稈處理土壤細(xì)菌群落組曾在培養(yǎng)的第三周和第五周達(dá)到顯著性差異，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩種秸稈處理土壤間細(xì)菌群落組成的差異逐漸減小，到培養(yǎng)的第１１周，兩種秸稈處理土壤間細(xì)菌群落組成的差異基本消失。王洪興等［２５］通過研究轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻及其親本秸稈在降解過程中對土壤微生物主要類群的影響，發(fā)現(xiàn)在秸稈降解過程中，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因組細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因組，而真菌數(shù)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因組，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因組反硝化細(xì)菌活性顯著低于非轉(zhuǎn)基因組，而解磷微生物活性在各處理組之間無明顯差異。

但是，近年來Ｄｅｖａｒｅ等［２６］的一些研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物并未給土壤生態(tài)系統(tǒng)造成重要影響。２００４年，Ｄｅｖａｒｅ等［２６］經(jīng)過半年多田間種植轉(zhuǎn)Ｃｒｙ３Ｂｂ殺蟲蛋白基因的轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米，并通過末端限制片段長度多態(tài)性分析評估了其根際與周圍的土壤微生物數(shù)量、活躍度（包括土壤氮素礦化量、短期土壤消化作用、土壤呼吸作用）和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)同時期轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米根際與周圍的土壤中，上述指標(biāo)均不存在顯著性差異，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米未給土壤微生物數(shù)量、活躍度及細(xì)菌群落生態(tài)帶來重要影響。２００７年，Ｄｅｖａｒｅ等［２７］報道，經(jīng)過３年的田間種植轉(zhuǎn)Ｃｒｙ３Ｂｂ玉米，并通過測定種植３年轉(zhuǎn)Ｃｒｙ３Ｂｂ玉米每年３個時期（作物種植前、開花期、收獲期）收集的大批土壤樣本的土壤微生物數(shù)量、活躍度數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Ｂｔ玉米對土壤微生物數(shù)量和活躍度的影響，呈現(xiàn)出明顯的周期性變化。與其２００４年報道的試驗(yàn)結(jié)論一致，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米未給土壤生態(tài)系統(tǒng)帶來重要影響。但是，目前對土壤中轉(zhuǎn)Ｂｔ殺蟲蛋白的生態(tài)效應(yīng)研究明顯不足，評價的物種單一，周期短，對土壤中敏感微生物的研究僅局限在土壤微生物不到１％的可人工培養(yǎng)的種類上，尚未有對土壤微生物群落、生物多樣性及功能的長期定位研究。我國在這方面的研究仍未引起足夠的重視，而且研究方法和手段也比較落后。隨著人們安全性意識的不斷加強(qiáng)，必將增加這方面的研究投入，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

２．３轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物對土壤動物和植物的影響

在種植過轉(zhuǎn)Ｂｔ基因玉米或者加入其秸稈１２０～１８０ ｄ后的土壤上，無論種植非轉(zhuǎn)基因玉米、胡蘿卜、蘿卜或甘藍(lán)，在這些后茬作物組織中用ＥＬＩＳＡ檢測或幼蟲生測均未檢測到Ｂｔ殺蟲蛋白，但是其土壤中仍有活性的Ｂｔ殺蟲蛋白，表明土壤中已經(jīng)存在的Ｂｔ殺蟲蛋白不會被后茬非轉(zhuǎn)基因作物吸收和利用［２２］，不會對這些非轉(zhuǎn)基因作物的生長和特性產(chǎn)生影響。將蚯蚓培養(yǎng)在被Ｂｔ殺蟲蛋白污染的土壤中４５ ｄ后，其腸道內(nèi)容物和糞便中均能檢測到Ｂｔ殺蟲蛋白，但這些Ｂｔ殺蟲蛋白對蚯蚓種群的數(shù)量和生長狀況沒有影響，將蚯蚓轉(zhuǎn)移到不含Ｂｔ殺蟲蛋白的新鮮無污染土壤中培養(yǎng)２～３ ｄ后，其腸道內(nèi)容物中的Ｂｔ殺蟲蛋白消失［２８］，表明結(jié)合態(tài)Ｂｔ殺蟲蛋白不會影響蚯蚓的正常生長。

３轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的影響因素

目前，關(guān)于Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解時間的報道差異較大，可能是因?yàn)橥寥乐校拢魵⑾x蛋白的降解受到多種因素的影響，其中主要因素可能是土壤微生物、土壤濕度、酸堿度、黏粒組成及含量。

３．１土壤生物對Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的影響

土壤生物是Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中發(fā)生失活或降解的主要作用因子之一，尤其是土壤微生物，它是影響Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的最關(guān)鍵因子。Ｐａｌｍ等［１９］研究發(fā)現(xiàn)，在種植轉(zhuǎn)Ｂｔ基因棉花的土壤中，Ｂｔ殺蟲蛋白的量在前１４ ｄ快速下降，然后下降趨勢逐漸減慢。而土壤經(jīng)γ射線處理后，其中的Ｂｔ殺蟲蛋白降解速度明顯減慢。白耀宇等［２９］研究發(fā)現(xiàn)，在前６ ｄ內(nèi)ＫＭＤ２葉片凍干粉Ｃｒｙ１Ａｂ蛋白的降解速度相當(dāng)快，這與Ｐａｌｍ等［１９］的研究結(jié)果較為相似，推測其快速降解的主要原因是Ｃｒｙ１Ａｂ殺蟲蛋白在自由狀態(tài)下被土壤微生物作為一種碳源或氮源分解利用。土壤微生物的數(shù)量及其生物活性與土壤的類型密切相關(guān)，通常有機(jī)質(zhì)含量高的土壤中微生物數(shù)量多，土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白易被土壤中的微生物降解；同時，一般情況下土壤ｐＨ值較高則土壤微生物活性也較高，有利于Ｂｔ殺蟲蛋白的降解。另外，土壤生態(tài)環(huán)境中的昆蟲也能消耗一些Ｂｔ殺蟲蛋白，即土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白進(jìn)入昆蟲（包括靶標(biāo)害蟲和非靶標(biāo)昆蟲）體內(nèi)被降解。

３．２土壤濕度對Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的影響

土壤濕度是影響Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解速度的主要因素之一［３０］。白耀宇等［２９］研究表明，土壤淹水可顯著促進(jìn)Ｃｒｙ１Ａｂ的降解，且淹水后Ｃｒｙ１Ａｂ的降解動態(tài)在不同土壤之間十分相似，但是淹水對Ｃｒｙ１Ａｂ降解的促進(jìn)作用僅發(fā)生在前１２ ｄ之內(nèi)，此后多數(shù)時間內(nèi)淹水與非淹水處理間Ｃｒｙ１Ａｂ的降解無顯著差異。

３．３土壤酸堿度對Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的影響

土壤酸堿度對土壤中Ｂｔ殺蟲蛋白的降解也有一定的影響，土壤ｐＨ值較高，則土壤中Ｂｔ殺蟲蛋白降解較快，而土壤ｐＨ值較低，則不利于Ｂｔ殺蟲蛋白的降解。首先，土壤中微生物活性受到土壤酸堿度的影響。一般情況下，土壤ｐＨ值高，則土壤微生物活性就大，微生物分解Ｂｔ殺蟲蛋白的能力就強(qiáng)，致使大多數(shù)的Ｂｔ殺蟲蛋白被微生物降解。在ｐＨ值為中性的土壤中，利用生物測定法檢測Ｂｔ殺蟲蛋白的活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)Ｂｔ棉花和玉米中的Ｂｔ殺蟲蛋白的活性很快被降解，而ｐＨ值較低的土壤則不利于微生物對Ｂｔ殺蟲蛋白的降解［３１］。其次，土壤中具有表面活性的微粒對Ｂｔ殺蟲蛋白的吸附能力也受到土壤酸堿度的影響。ｐＨ值在４．４～１０．０時，蒙脫石和高嶺石對Ｂｔ殺蟲蛋白的吸附量都隨ｐＨ值的升高而呈線性降低，由于游離態(tài)的Ｂｔ殺蟲蛋白更容易降解，因此Ｂｔ殺蟲蛋白的降解率隨ｐＨ值的升高而呈線性升高［３２］。Ｔａｐｐ等［３３］報道Ｂｔｋ和Ｂｔ殺蟲蛋白與土壤黏土礦物的吸附在ｐＨ值為６時達(dá)到最大值，因?yàn)椋拢魵⑾x蛋白的等電點(diǎn)在５．５左右。當(dāng)土壤的ｐＨ值接近殺蟲蛋白的等電點(diǎn)時，中性殺蟲蛋白所受的斥力最小，致使殺蟲蛋白與土壤表面有最大的接觸機(jī)會，從而提高殺蟲蛋白與土壤顆粒的吸附力。結(jié)合到高嶺石的殺蟲蛋白可被ｄｄＨ２Ｏ解吸，而結(jié)合在蒙脫石上的Ｂｔ殺蟲蛋白只能被０．２％的Ｔｒｉｓ緩沖液解吸。另外，Ｂｔ殺蟲蛋白在自然含有或人為加入高嶺石的土壤中的殺蟲活性比自然含有或人為加入蒙脫石的土壤高，且持續(xù)的時間長，其主要原因就是含蒙脫石的土壤ｐＨ值高，細(xì)菌活性強(qiáng)［３４］。

３．４土壤黏粒對Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中降解的影響

土壤中黏粒的含量和組分也在很大程度上影響Ｂｔ殺蟲蛋白的降解。Ｓｔｏｔｚｋｙ等［３５］研究發(fā)現(xiàn)，土柱中Ｂｔ蛋白含量隨著黏粒濃度的升高而降低。Ｄｏｎｅｇａｎ等［３６］研究發(fā)現(xiàn)在沙壤土和黏壤土中，轉(zhuǎn)Ｃｒｙ１Ａｂ基因棉花葉片和莖稈分解釋放殺蟲蛋白的高活性狀態(tài)可分別持續(xù)２８ ｄ和４０ ｄ，這是因?yàn)轲と劳林泻懈嗟耐寥阑钚灶w粒，而土壤中的沙粒和泥沙粒由于不具有表面活性的緣故，則不能吸附毒素。而進(jìn)一步的研究證實(shí)，Ｂｔ殺蟲蛋白與土壤黏粒的結(jié)合，大大減少了其在土壤中的降解。

此外，光照（特別是紫外線）、氣候和轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物的品種類型、Ｂｔ殺蟲蛋白濃度也影響其在土壤中的降解速率。

４展望

目前的研究表明，轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物通過各種形式向土壤生態(tài)系統(tǒng)中釋放Ｂｔ殺蟲蛋白。位于地表的Ｂｔ殺蟲蛋白，可以很容易被光降解，而土壤中的Ｂｔ殺蟲蛋白可以與土壤中具有表面活性的顆粒吸附并緊密結(jié)合，從而延緩了土壤微生物對Ｂｔ殺蟲蛋白的降解，致使大量的Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中長期滯留甚至富集。由于Ｂｔ殺蟲蛋白與土壤顆粒結(jié)合后其蛋白結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變，依然保持較高的活性，因此，Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中的殘留和富集可能會對土壤中非靶標(biāo)生物造成不良影響，從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。轉(zhuǎn)基因植物在進(jìn)入田間釋放和商業(yè)化應(yīng)用的過程中應(yīng)該開展土壤生態(tài)學(xué)影響的研究和監(jiān)測，相對而言，發(fā)達(dá)國家在這方面已開展了不少工作，但由于研究方法和試驗(yàn)條件的限制，許多問題仍未弄清。轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物環(huán)境影響的研究是一個長期而復(fù)雜的過程，因此，需要從不同的角度開展系統(tǒng)的研究工作，為全面評價轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物釋放Bt殺蟲蛋白可能引起的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險提供理論依據(jù)。

大面積種植轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物后，會產(chǎn)生大量的含有Ｂｔ殺蟲蛋白的植物秸稈，這些秸稈如果“秸稈還田”則使秸稈中含有的Ｂｔ殺蟲蛋白進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，造成Ｂｔ殺蟲蛋白在土壤中的累積，從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。因此，我們需要對轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物秸稈的處置和綜合利用進(jìn)行研究，開發(fā)轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物秸稈處置新技術(shù)，在利用秸稈的同時降解秸稈中的Ｂｔ殺蟲蛋白，從而大大降低進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)的Ｂｔ殺蟲蛋白。秸稈是一種非常豐富的生物質(zhì)能源，被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域，例如利用植物纖維開發(fā)生物燃料，通過微生物處理生產(chǎn)生物肥料、生物飼料，利用植物纖維進(jìn)行造紙等。在利用轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物秸稈生產(chǎn)沼氣、生物肥料的過程中，需要對秸稈中Ｂｔ殺蟲蛋白的降解情況進(jìn)行研究和監(jiān)測，爭取通過對生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)（比如加入特定的微生物和酶）來提高秸稈中Ｂｔ殺蟲蛋白的降解速度，從而從根本上消除Ｂｔ殺蟲蛋白對生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響。

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過一段時間的研究，從轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻種植田篩選出了一種能夠降解Ｂｔ殺蟲蛋白的細(xì)菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下，４ ｄ內(nèi)該細(xì)菌能夠降解轉(zhuǎn)Ｂｔ基因水稻秸稈中９０％以上的Ｂｔ殺蟲蛋白，這對于利用轉(zhuǎn)Ｂｔ基因作物秸稈生產(chǎn)生物肥料、沼氣過程中，降解秸稈中的Ｂｔ殺蟲蛋白，徹底消除Ｂｔ殺蟲蛋白對生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響，具有非常高的應(yīng)用價值。

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