液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE 抑制肽發(fā)酵條件優(yōu)化

鞠興榮 金 晶 王立峰,2 袁 建 何 榮,2

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1,南京 210003)(江南大學(xué)食品學(xué)院2,無(wú)錫 214122)

液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽ACE 抑制肽發(fā)酵條件優(yōu)化

鞠興榮1金 晶1王立峰1,2袁 建1何 榮1,2

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1,南京 210003)(江南大學(xué)食品學(xué)院2,無(wú)錫 214122)

以菜籽粕為原料,通過(guò)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽 ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率為指標(biāo)通過(guò)單因素試驗(yàn)得到液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵條件,再以響應(yīng)面法分析法,優(yōu)化了枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的工藝條件,確定枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽 ACE抑制肽的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量,最佳工藝條件分別為 20 h、38℃和 1×108個(gè) /mL。優(yōu)化后的菜籽 ACE抑制肽抑制率達(dá)到 70.95%。

枯草芽孢桿菌 菜籽肽 液態(tài)發(fā)酵 ACE抑制肽 響應(yīng)面分析法

ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑通過(guò)抑制 ACE的活性而達(dá)到降血壓的作用,目前使用的很多合成的ACE抑制劑在降血壓的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的副作用[1],而植物源 ACE抑制肽具有安全性高,副作用少,易吸收的優(yōu)點(diǎn)[2],因此成為了ACE抑制肽研究的熱點(diǎn)。菜籽粕是菜籽榨油之后的副產(chǎn)品,其中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 35%～42%,且為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[3-4]。將菜籽粕發(fā)酵制備 ACE抑制肽,可以充分的利用菜籽蛋白資源,達(dá)到變廢為寶的作用。目前發(fā)酵法制備大豆和牛奶的ACE抑制肽的研究在我國(guó)已有報(bào)道[5-7],而使用液態(tài)發(fā)酵制備菜籽ACE抑制肽的研究目前在國(guó)內(nèi)還屬于空白,因此具有很高的研究?jī)r(jià)值。

在利用枯草芽孢桿菌 10160液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,著重探討了搖床轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響,應(yīng)用單因素和響應(yīng)面分析法 (Response surface analysis,RSA)對(duì)菜籽液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以ACE抑制率為響應(yīng)值,采用多元二次回歸擬合出方程,得到了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽蛋白肽的最佳發(fā)酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

B acillus.subtilis10160等產(chǎn)蛋白酶菌種:中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;菜籽粕,以 canola菜籽為原料,通過(guò)索氏抽提脫油制得,含粗蛋白 43.26%;牛血清白蛋白、細(xì)胞色素、鈷胺酰胺 (VB12)、Gly-Gly-Tyr-Arg、ACE(0.25U)、HHL、Gly-Gly-Tyr-Arg:Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;GL-20B型高速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;全溫立式振蕩培養(yǎng)箱:太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;722N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

將保藏的枯草芽孢菌種接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (牛肉膏 0.3 g/100 mL,蛋白胨 1 g/100 mL,氯化鈉 0.5 g/100 mL,瓊脂 2.5 g/100 mL),在 30℃下進(jìn)行恒溫靜止培養(yǎng) 24 h,使其轉(zhuǎn)接活化。

1.3.2 種子培養(yǎng)

挑取 2環(huán)枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基活化后菌株,接入裝有 100 mL種子培養(yǎng)基 (牛肉膏 0.3 g/100 mL,蛋白胨 1 g/100 mL,氯化鈉 0.5 g/100 mL)的250 mL錐形瓶中,8層紗布封口,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),控制溫度 30℃,轉(zhuǎn)速 180 r/min,培養(yǎng) 24 h,使其菌體濃度達(dá)到 108個(gè) /mL。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

從已制備好的種子培養(yǎng)基中取出一定體積的菌懸液接入已滅菌的裝有 100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基 (磷酸二氫鉀 0.45 g/100 mL,葡萄糖 0.8 g/100 mL,料液比1∶23)的 250 mL錐形瓶中進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵錐形瓶用 8層紗布封口,控制在 38℃,180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 發(fā)酵液處理

將培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵產(chǎn)物取出,2～4℃下4 000×g離心 15 min,測(cè)定其上清液體積,用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液,除去不溶物和細(xì)菌,備用。

1.3.5 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從活化后的枯草芽孢桿菌斜面上挑取 2環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基中,控制培養(yǎng)溫度 30℃,轉(zhuǎn)速 180 r/min,每隔 2 h取一次樣 (5 mL),高速離心下沉淀菌體 (4 000×g,15 min),去除上清液后,菌體沉淀以無(wú)菌蒸餾水懸浮,混勻定容至 10 mL,于 600 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.6 細(xì)菌數(shù)量測(cè)定

血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定[8]。

1.3.7 菜籽多肽得率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]所述方法,取 2.5 mL處理液,加入等體積 10%的三氯乙酸 (TCA),靜置 30 min,2～4℃下,5 000×g離心 20 min,取 2 mL上清液,加 8 mL雙縮脲試劑,25℃下靜置 30 min,測(cè) OD540值。肽得率按公式 (1)計(jì)算:

1.3.8 ACE抑制活性的測(cè)定

ACE抑制活性的測(cè)定參照 Cushman等[10]的方法,做出適當(dāng)?shù)男薷?具體步驟如下:用含有 0.3 mol/L NaCl的 0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液 (pH 8.3)將 HHL配制成 5.0 mmol/L的溶液。取 100μL的 HHL和40μL的水解產(chǎn)物混合,于 37℃下保溫 3 min后,加入 10μL ACE(溶于蒸餾水,活力為 0.1 U/mL),混勻后 37℃保溫 30 min,再加入 250μL的 1 mol/L的HCl溶液以終止反應(yīng),再加入 1.7 mL醋酸乙酯,15 s振蕩混勻,5 000×g離心 10 min,用移液管吸取1 mol/L醋酸乙酯層,真空冷凍干燥 2 h后,加入 3 mL蒸餾水,在 228 nm處測(cè)定其吸光度。ACE抑制活性按公式 (2)計(jì)算:

式中:A為含有菜籽多肽液和 ACE溶液時(shí)所測(cè)的吸光度;B為不含有菜籽多肽液,但含有 ACE溶液時(shí)所測(cè)的吸光度;C為含有菜籽多肽液,但不含 ACE溶液時(shí)所測(cè)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖比較快,在適宜條件下,20～30 min就可以分裂一次,從圖 1可以看到,在發(fā)酵的開(kāi)始階段,菌體數(shù)目增加并不多 (0～10 h),一定時(shí)間后,菌體數(shù)目增長(zhǎng)很快 (12～28 h),隨后菌體增長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期 (24～32 h),在 34 h后,隨著菌體數(shù)目增長(zhǎng),培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和自身代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生,菌體進(jìn)入衰亡期。因此,12～28 h是本菌株的對(duì)數(shù)期,由于對(duì)數(shù)期的微生物細(xì)胞生長(zhǎng)平衡,菌體內(nèi)酶系活躍,代謝旺盛,群體的形態(tài)與生理特征最一致,并且抗不良環(huán)境的能力強(qiáng),所以在試驗(yàn)中,均以培養(yǎng) 20 h左右的菌株為種子液。

圖 1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線圖

2.2 肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

用 5%TCA配制不同濃度的 Gly-Gly-Tyr-Arg標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照多肽含量測(cè)定方法顯色,于 540 nm下測(cè)定OD值。以多肽質(zhì)量為橫坐標(biāo) x(mg),OD值為縱坐標(biāo) y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖 2),得到回歸方程y=0.025 7x+0.002 9,R2=0.999 5。

圖 2 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液態(tài)發(fā)酵肽得率和 ACE抑制率的影響

在液態(tài)發(fā)酵當(dāng)中,搖床的轉(zhuǎn)速會(huì)影響液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣量,使得培養(yǎng)基中溶氧量變化,從而影響菌種的生長(zhǎng)和發(fā)酵。由圖 3可以看出,搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液態(tài)發(fā)酵的影響不是很明顯,ACE抑制活性極差為 0.6%。這可能是由于液態(tài)發(fā)酵時(shí)液態(tài)培養(yǎng)基接觸空氣的面積較大,且處于不斷震蕩當(dāng)中,培養(yǎng)基的溶氧充足,在較低轉(zhuǎn)速下即可滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)氧氣的需求,因此,當(dāng)轉(zhuǎn)速改變,對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響不是很明顯,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到 180 r/min時(shí),為液態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)轉(zhuǎn)速,肽得率可以達(dá)到 23.19%,ACE抑制活性達(dá)到 62.08%。

圖 3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)肽得率和ACE抑制活性的影響

2.4 接種量對(duì)液態(tài)發(fā)酵肽得率和 ACE抑制率的影響

由圖 4可以看出,接入枯草芽孢桿菌的量對(duì)液態(tài)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生一定的影響,當(dāng)接種量過(guò)少,產(chǎn)生的蛋白酶量會(huì)較少,從而使得肽得率較少,ACE抑制活性較低,而接種量過(guò)多,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能完全滿足枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)需要,也會(huì)使得枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)受到限制,導(dǎo)致發(fā)酵效果不佳。當(dāng)接種量達(dá)到 1×108個(gè) /mL時(shí),肽得率和 ACE抑制活性均達(dá)到最高值,再增加接種量,會(huì)導(dǎo)致肽得率的明顯降低,因此,液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為 1×108個(gè) /mL。

圖 4 接種量對(duì)肽得率和ACE抑制活性的影響

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)液態(tài)發(fā)酵肽得率和 ACE抑制率的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖以及產(chǎn)酶的主要因素之一,因此,在液態(tài)發(fā)酵中,對(duì)發(fā)酵溫度的控制十分關(guān)鍵。由圖 5可以看出,溫度過(guò)低和過(guò)高都不利于枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵。當(dāng)溫度過(guò)低,枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)不佳,產(chǎn)酶量也較少,而溫度過(guò)高,會(huì)抑制其生長(zhǎng),甚至導(dǎo)致其死亡。當(dāng)發(fā)酵溫度在 38℃時(shí),菜籽肽得率和 ACE抑制活性均達(dá)到最大值,分別為23.36%和 62.47%,因此,液態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)溫度條件為 38℃。

圖 5 發(fā)酵溫度對(duì)肽得率和ACE抑制活性的影響

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)液態(tài)發(fā)酵肽得率和 ACE抑制率的影響

由圖 6可以看出,發(fā)酵時(shí)間對(duì)液態(tài)指標(biāo)有顯著的影響。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到 24 h時(shí),肽得率和 ACE抑制活性均達(dá)到最高值,而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),肽得率和ACE抑制活性逐步降低,推測(cè)其原因是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行,已經(jīng)得到的小肽進(jìn)一步水解,從而肽得率明顯降低,而隨著小肽的水解,一些具有 ACE抑制活性的小肽也被進(jìn)一步的水解成為了不具有ACE抑制活性的短肽或氨基酸,因此,ACE抑制活性也隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步降低。因此,液態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)時(shí)間為 24 h,此時(shí)的肽得率和 ACE抑制活性均為最高,分別為 23.85%和 64.38%。

圖 6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)肽得率和ACE抑制活性的影響

2.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析

2.6.1 響應(yīng)面分析法分析因素的選取及試驗(yàn)結(jié)果

在單因子試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,根據(jù) Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,對(duì)液態(tài)發(fā)酵影響較大的 3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基條件。以菜籽肽 ACE抑制率為響應(yīng)值,自變量為發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量,分別以 X1、X2和 X3代表,按方程 xi=(Xi-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼,其中,xi為自變量的編碼值,Xi為自變量的真實(shí)值,X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值,ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)。因子編碼及各自變量水平見(jiàn)表 1。

為了最優(yōu)擬合多元二次模型方程各項(xiàng)系數(shù),依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,對(duì)影響菜籽肽得率的發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵內(nèi)在因素進(jìn)行了 15組試驗(yàn),15組試驗(yàn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),試驗(yàn)號(hào) 1～12是析因試驗(yàn),13～15是中心試驗(yàn)。其中析因點(diǎn)為自變量取值在 x1,x2,x3所構(gòu)成的三維定點(diǎn),零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn),零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù) 3次,以估計(jì)試驗(yàn)誤差,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

利用Designexpert軟件對(duì)表試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽產(chǎn) ACE抑制肽發(fā)酵條件編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程為:

其中 Y為 ACE抑制率,X1、X2、X3分別代表發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量。方程中 X1,X2的系數(shù)均較大,表明發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì) ACE抑制效率最具有顯著意義。一次項(xiàng),二次項(xiàng)和交互項(xiàng)系數(shù)大多為負(fù)值,可以認(rèn)為一次項(xiàng),二次項(xiàng)和交互項(xiàng)方程主要對(duì)ACE抑制率起負(fù)作用。

從該模型的方差分析表 3可見(jiàn),試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性 (P=0.001 9),P值越小,其因子越顯著。失擬項(xiàng)在 a=0.05水平上不顯著 (P=0.120 0>0.05),其校正決定系數(shù)為0.927 2,表明此模型擬合優(yōu)度好,ACE抑制率僅有7.28%的總變異不能由此模型進(jìn)行解釋。

對(duì)上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明 (見(jiàn)表4),發(fā)酵時(shí)間對(duì) ACE抑制率的影響極顯著 (P<0.01),發(fā)酵溫度對(duì) ACE抑制率的影響顯著 (P<0.5),表明在發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)ACE抑制率有顯著影響;3個(gè)因素之間的交互作用影響也都顯著,說(shuō)明在培養(yǎng)基中,發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量之間的交互作用亦能對(duì)ACE得率造成顯著影響。通過(guò)顯著性檢驗(yàn)可以看出,發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽肽得率的影響最大,發(fā)酵溫度的影響次之,接種量的影響在本試驗(yàn)范圍內(nèi)最小。

表 1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及菜籽肽得率實(shí)測(cè)值及預(yù)測(cè)值

表 3 菜籽肽得率二次多項(xiàng)模型方差分析表

表 4 菜籽肽得率回歸方程系數(shù)顯著檢驗(yàn)

2.6.2 ACE抑制率的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

模型的響應(yīng)面圖及其等高線圖可比較直觀地解釋各變量和變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線圖還可揭示出各變量之間交互作用的顯著性。在接種量保持固定的情況下,發(fā)酵時(shí)間 (A)和發(fā)酵溫度 (B)對(duì)ACE抑制活性影響交互作用的等高線圖和曲面圖如圖 7所示,發(fā)酵溫度 (B)和接種量 (C)對(duì) ACE抑制活性影響交互作用的等高線圖和曲面圖如圖 8所示。

通過(guò)圖 7可以對(duì)發(fā)酵時(shí)間和溫度交互影響 ACE抑制活性的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià),并從中確定最佳的因素水平范圍。由圖 7可以看出,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在12～22.8 h,發(fā)酵溫度在 37.5～38.8℃,ACE抑制率高于 70%。

通過(guò)圖 8可以對(duì)發(fā)酵溫度和接種量交互影響ACE抑制活性的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià),并從中確定最佳的因素水平范圍。由圖 8可以看出,當(dāng)發(fā)酵溫度在 37.5～38.4℃接種量在 0.6×108～2×108個(gè) /mL,ACE抑制率高于 70%。

2.6.3 液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)ACE抑制肽最優(yōu)條件的確立

從圖 7、圖 8中可以看出 X1、X2、X3存在極值點(diǎn),為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳點(diǎn)的值,對(duì)回歸方程 (3)取一階偏導(dǎo)等于零并整理得:-2.07-1.98X2+0.6X3-3.88X1=0;-0.63-1.98X1-2.69X3-10.9X2=0;0.17+0.6X1-2.69X2-11.74X3=0,解得 X1=-0.57、X2=0.05、X3=-0.03。代入回歸方程 (3),解得預(yù)測(cè)的最高ACE抑制率為 70.95%。轉(zhuǎn)換后得到最佳培養(yǎng)基配比為發(fā)酵時(shí)間 19.2 h,發(fā)酵溫度38.1℃,接種量 1×108個(gè) /mL。為了方便培養(yǎng)基的配制,確定培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為:發(fā)酵時(shí)間 20 h,發(fā)酵溫度38℃,接種量 1×108個(gè) /mL。

2.6.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù) Box-Behilken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用 Designexpert軟件獲得了 ACE抑制活性最高時(shí)的最佳工藝條件。為了驗(yàn)證其優(yōu)化結(jié)果的可靠性,在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行 5組平行試驗(yàn),所得ACE抑制活性分別 70.08%、71.53%、71.14%、70.69%、69.95%,平均值為 70.68%,回歸方程所得到的ACE抑制活性預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值相接近,說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè) ACE抑制活性值。

3 結(jié)論

以ACE抑制率為考察指標(biāo),經(jīng)單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量對(duì) ACE抑制率有顯著影響,在此基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析方法,根據(jù) Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)了 3因素 3水平試驗(yàn),用Design-Expert軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),得到了一個(gè) ACE抑制率回歸模型以及取得模型最優(yōu)值時(shí)各因素水平。試驗(yàn)結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵中發(fā)酵時(shí)間,發(fā)酵溫度和接種量的最佳工藝條件分別為20 h、38℃和 1×108個(gè) /mL,在該最佳工藝條件下,ACE抑制率可達(dá) 70.95%。在枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,ACE抑制率又提高了大約2%。綜合枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn) ACE抑制肽的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果和發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果,可以得出其最佳發(fā)酵條件為:磷酸二氫鉀 0.45%,葡萄糖 0.8%,料液比 1∶23,初始 pH7,搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min,發(fā)酵時(shí)間 20 h,發(fā)酵溫度 38℃,接種量 1×108個(gè) /mL,在此基礎(chǔ)上,ACE抑制活性可達(dá) 70.95%。

微生物作為酶制劑的重要來(lái)源,采用液態(tài)發(fā)酵法制備 ACE抑制肽,可以很好的節(jié)約成本,為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)菜籽 ACE抑制肽提供一條可行的途徑,同時(shí),還可以通過(guò)液態(tài)發(fā)酵的方法將脫苦和制肽一步完成,通過(guò)絮凝劑將微生物沉淀,并聯(lián)用多種分離純化技術(shù),可以制得高純度的ACE抑制肽。

菜籽 ACE抑制肽可以廣泛的運(yùn)用到食品,醫(yī)療行業(yè),具有很高的利用價(jià)值,本試驗(yàn)運(yùn)用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵法制備菜籽 ACE抑制肽具有生產(chǎn)成本低、肽得率高、ACE抑制率高等特點(diǎn),在工業(yè)化生產(chǎn)菜籽ACE抑制肽上是很有潛力的方法。

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Opti mization ofLiquid Fer mentation for Producing Rapeseed Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides

Ju Xingrong1Jin Jing1Wang Lifeng1,2Yuan Jian1He Rong1,2
(College of Food Science and Engineering,NanjingUniversity of Finance&Economics,Key Laboratory of Grain&OilsQuality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province1,Nanjing 210003)
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University2,Wuxi 214122)

Rapeseed mealwas used to produce angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory peptides withB acillus subtilisliquid-state fermentation.W ith rapeseed peptide yield and ACE inhibitory rate as indexes for single factor test,the technology conditions for producingACE inhibitory peptideswere optimized by response surface analysis.Results:The optimal conditions are fer mentation ti me 20 h,fer mentation temperature 38℃,and inoculum size 1×108ind/mL.Under the above conditions,the ACE inhibitory rate reaches 70.95%.

Bacillus subtilis,rapeseed peptide,liquid-state fermentation,ACE inhibitory peptides,response surface methodology

TS209

A

1003-0174(2011)01-0096-06

863計(jì)劃(2007AA10Z331),國(guó)家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2009C10045),江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目,江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[cx(10)444]

2010-01-11

鞠興榮,男,1957年出生,教授,博士,食品營(yíng)養(yǎng)及功能性成分研究與開(kāi)發(fā)