對(duì)大豆異黃酮育種評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法的探討

張永忠 許 晶

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系1,哈爾濱 150030)

(教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,哈爾濱 150030)

對(duì)大豆異黃酮育種評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法的探討

張永忠1,2許 晶1

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系1,哈爾濱 150030)

(教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,哈爾濱 150030)

大豆異黃酮育種目前采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)是品種中大豆異黃酮總的含量,采用的檢測(cè)方法是高效液相色譜法(HPLC)或紫外分光光度法?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)決定生物活性,不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的各種大豆異黃酮單體具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。隨著科學(xué)研究的發(fā)展,這個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)還需要不斷完善,其檢測(cè)方法也應(yīng)當(dāng)能與國(guó)際研究接軌,這樣將更適合于現(xiàn)代科學(xué)研究的發(fā)展。簡(jiǎn)述了大豆異黃酮育種的評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法,建議分別以染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評(píng)價(jià)指標(biāo),建議采用 AOAC公布的大豆異黃酮的檢測(cè)方法。

大豆異黃酮 育種 評(píng)價(jià)指標(biāo) AOAC檢測(cè)方法

大豆異黃酮具有抗乳腺癌和前列腺癌等多種重要的生理功能,所以育種專家們致力于培育富含大豆異黃酮的大豆品種。在培育高含量異黃酮大豆品種研究過(guò)程中,首先要確定評(píng)價(jià)指標(biāo)和檢測(cè)方法。目前采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)是品種中大豆異黃酮總的含量,采用的檢測(cè)方法是高效液相色譜法(HPLC)或紫外分光光度法[1-2]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)決定生物活性,不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的各種大豆異黃酮單體具有不同的生物活性,生物活性作用的大小也不同。只以大豆異黃酮總的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),不適應(yīng)于現(xiàn)代科學(xué)研究的發(fā)展,所以目前的這個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)還需要完善。采用紫外分光光度法只能夠測(cè)定大豆異黃酮總的含量,不能測(cè)定各個(gè)單體的含量。采用高效液相色譜法可以測(cè)定大豆異黃酮單體的含量,國(guó)內(nèi)就有應(yīng)用 12種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[3],但其檢測(cè)方法過(guò)于繁瑣,而 12種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品在國(guó)內(nèi)是很難購(gòu)到的,分析檢測(cè)成本也比較高。即使有了 12種標(biāo)準(zhǔn)品,由于其中部分標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定,在存放過(guò)程中會(huì)自動(dòng)分解而不宜再用。因此,目前的這個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)和檢測(cè)方法都是應(yīng)當(dāng)改進(jìn)和完善的。

1 建議分別以染料木苷類異黃酮和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評(píng)價(jià)指標(biāo)

天然存在的大豆異黃酮共有 12種,可以分為 3類,即黃豆苷類 (daidzin groups)、染料木苷類 (genis2 tin groups)和黃豆黃素苷類 (glycitin groups),分別以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招秃捅；咸烟擒招偷?4種形式存在[4-5]。3種游離型的異黃酮苷元包括黃豆苷元 (daidzein)、染料木黃酮(genistein)和黃豆黃素 (glycitein)。這 3種苷元分別與β-D-葡萄糖的苷羥基結(jié)合生成 3種葡萄糖苷形式的異黃酮,即黃豆苷 (daidzin)、染料木苷 (genis2 tin)和黃豆黃素苷 (glycitin)。3種葡萄糖苷形式的異黃酮中葡萄糖第 6位的羥基分別與乙?；Y(jié)合,則生成了 3種乙?；咸烟擒招彤慄S酮;3種葡萄糖苷形式的異黃酮中葡萄糖第 6位的羥基分別與丙二?；Y(jié)合,則生成了 3種丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮。

國(guó)內(nèi)在大豆異黃酮研究中所用名詞術(shù)語(yǔ)比較混亂,不夠科學(xué)、嚴(yán)肅、規(guī)范?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)決定化合物的性質(zhì),也決定生物活性,其名稱應(yīng)能反映出化合物的結(jié)構(gòu)。本文將 genistein譯成染料木黃酮[6],這是因?yàn)?genistein是大豆異黃酮的苷元,從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看是黃酮類化合物,化學(xué)名稱為 5,7,4′-三羥基異黃酮。

染料木黃酮是大豆異黃酮的活性因子。任何物質(zhì)的宏觀性質(zhì),主要是由其內(nèi)在的結(jié)構(gòu)決定的。同樣,染料木黃酮之所以被稱為植物雌激素,是因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物內(nèi)源雌激素雌二醇結(jié)構(gòu)相似,具有活性基團(tuán)二酚羥基,其中染料木黃酮 7,4′兩個(gè)羥基間的距離幾乎等于 17β-雌二醇上 3,17位羥基間的距離。正是由于這種特殊的結(jié)構(gòu),能夠與雌激素靶細(xì)胞結(jié)合而呈現(xiàn)出一定的雌激素功能。染料木黃酮和17β-雌二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 1和圖 2。染料木黃酮具有多種生物活性和生理功能,美國(guó)國(guó)家癌癥研究所于 1996年已將其列入腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物臨床發(fā)展計(jì)劃之中,主要預(yù)防目標(biāo)是乳腺癌和前列腺癌[7]。國(guó)外研究每一種藥品或是生物活性因子,都明確標(biāo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)。如 2008年國(guó)外發(fā)表的部分研究論文[8-11],所研究的物質(zhì)都是染料木黃酮。

黃豆苷元也是大豆異黃酮的活性因子。2010年,伯克康奈爾醫(yī)學(xué)研究所、紐約亨特學(xué)院生物系、密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院、匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院、內(nèi)穆?tīng)柹镝t(yī)學(xué)研究所、羅徹斯特大學(xué)、亞拉巴馬伯明翰大學(xué)、波恩大學(xué) (麻醉科、重癥醫(yī)科)等對(duì)黃豆苷元進(jìn)行了臨床試驗(yàn)研究[12],通過(guò)精氨酸酶 1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)器的化學(xué)篩選,鑒別出大豆異黃酮黃豆苷元可作為一種臨床上許可的通過(guò)非 cAMP依賴途徑來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元的保護(hù)和再生作用的小分子。黃豆苷元還可穿過(guò)血 -腦屏障,不需經(jīng)過(guò)預(yù)處理就能發(fā)揮作用[12]。

大豆異黃酮粉是 12種異黃酮的混合物,其中除含有大豆蛋白等普通成分外還含有大豆皂苷 (so2 yasaponin)等生物活性物質(zhì),但是應(yīng)用大豆異黃酮粉進(jìn)行生物活性試驗(yàn)無(wú)法證明究竟是大豆異黃酮粉的活性還是大豆皂苷等化合物的生物活性?？茖W(xué)研究已經(jīng)證明 12種大豆異黃酮中,染料木黃酮和黃豆苷元具有較高的生物活性[8-12]。染料木黃酮和黃豆苷元存在于豆制品中被人類廣泛攝入已有幾千年歷史。染料木黃酮和黃豆苷元是從含有 2 000種 FDA臨床上許可的藥物的文庫(kù)和多種具有人類長(zhǎng)期安全食用記錄的天然化合物中篩選出來(lái)的化合物,所以有望成為安全的藥物[12]。因此培育富含染料木黃酮和黃豆苷元的大豆品種將具有重要意義。染料木黃酮和黃豆苷元各自的生物活性作用不同,分別培育出富含染料木黃酮和黃豆苷元的大豆品種可以用來(lái)作為制備不同功能的保健食品或是藥品的原料。應(yīng)用這樣的原料可以節(jié)省染料木黃酮和黃豆苷元分離的成本,對(duì)于科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐將更有意義。染料木苷類異黃酮包括染料木苷 (genistin)、乙酰基染料木苷 (6″-O-Acetylgenistin)、丙二酰基染料木苷(6″-O-Malonylgenistin)和染料木黃酮。染料木苷、乙酰基染料木苷和丙二?；玖夏拒战?jīng)水解后都能生成染料木黃酮。黃豆苷類異黃酮包括黃豆苷(daidzin)、乙?；S豆苷 (6″-O-Acetyldaidzin)、丙二?；S豆苷 (6″-O-Malonyldaidzin)和黃豆苷元。黃豆苷類異黃酮水解最終產(chǎn)物都是黃豆苷元。建議育種專家分別將染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評(píng)價(jià)指標(biāo),分別培育出富含染料木苷類異黃酮或黃豆苷類異黃酮的大豆品種。

2 建議采用 AOAC公布的大豆異黃酮檢測(cè)方法

美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC(Association ofOffi2 cialAnalytical Chemists)是一個(gè)統(tǒng)一的非盈利性科學(xué)組織,其在 2001年公布了大豆及大豆食品中異黃酮的測(cè)定方法[J.AOAC Int.84,1865(2001)]。

AOAC公布的大豆及大豆食品中異黃酮的測(cè)定方法分為提取、皂化和 HPLC檢測(cè)三個(gè)過(guò)程。待測(cè)試樣用甲醇的水溶液 (甲醇 ∶水 =80∶20,體積比)在65℃時(shí)提取 2 h。提取物在室溫下用氫氧化鈉溶液皂化,之后進(jìn)行酸化,過(guò)濾。濾液用甲醇 -水(50∶50,體積比)進(jìn)行稀釋。然后提取物離心澄清并通過(guò)液相色譜法進(jìn)行分析測(cè)定。異黃酮葡萄糖苷和苷元在 C18反相柱上以甲醇 -水為流動(dòng)相進(jìn)行分離,在紫外 260 nm處檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)總計(jì)異黃酮苷元和相應(yīng)葡萄糖苷形式的苷元等價(jià)物 (均以苷元為單位)的含量表示。

該檢測(cè)方法并沒(méi)有應(yīng)用高檔次儀器,僅采用 6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品,分析測(cè)定易于進(jìn)行。不采用12種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、僅用 6種異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品是有科學(xué)道理的。因?yàn)?3種丙二酰基類異黃酮和 3種乙?；惍慄S酮一般條件下是測(cè)不準(zhǔn)的。大豆種子中 3種丙二酰基異黃酮葡萄糖苷具有熱不穩(wěn)定性,5℃時(shí)貯存 5 d即自動(dòng)水解為葡萄糖苷型異黃酮。丙二?；咸烟擒招彤慄S酮干熱處理后分解得到乙?；咸烟擒招彤慄S酮。例如,經(jīng)過(guò)熱處理的大豆分離蛋白、組織蛋白和炒大豆等制品中的乙酰基葡萄糖苷型異黃酮含量很高,占總異黃酮含量的 30%～50%[13]。丙二酰基葡萄糖苷型異黃酮和乙?；咸烟擒招彤慄S酮,在加熱和堿性條件下,可以去掉丙二酰基和乙?；D(zhuǎn)化成葡萄糖苷型異黃酮。Coward等[14]發(fā)現(xiàn),在較高的溫度下,丙二酰基染料木苷和乙?；玖夏拒湛僧a(chǎn)生脫酯化作用生成丙二酸甲酯、乙酸甲酯和染料木苷;Pandjaitan等[15]在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究指出,其最佳轉(zhuǎn)化溫度為 50℃;此外,大豆異黃酮提取液在貯存過(guò)程中也會(huì)發(fā)生染料木苷衍生物向染料木苷的轉(zhuǎn)化[14],而葡萄糖苷型異黃酮比較穩(wěn)定,要在強(qiáng)酸高溫或酶存在下,才可水解去掉葡萄糖基而轉(zhuǎn)化為苷元型異黃酮[16]。檢測(cè)異黃酮時(shí)要對(duì)大豆樣品進(jìn)行處理,處理過(guò)程中丙二?；咸烟擒招彤慄S酮含量要減少,因?yàn)槊擊壬闪艘阴；咸烟擒招彤慄S酮,所以乙?；咸烟擒招彤慄S酮含量會(huì)增加。雖然這 2類異黃酮的含量無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)出,但是他們?cè)趬A性條件下會(huì)生成穩(wěn)定的葡萄糖苷型異黃酮。

有機(jī)化學(xué)中把酯鍵在堿性條件下水解稱為皂化。大豆異黃酮共有 12種,經(jīng)皂化之后簡(jiǎn)化成了 6種比較穩(wěn)定的異黃酮。所以 AOAC提供的方法中應(yīng)用了皂化技術(shù)。大豆異黃酮皂化的化學(xué)反應(yīng)方程式如下:

AOAC法只用了 6種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品:染料木苷 (genistin)、染料木黃酮 (genistein)、黃豆苷(daidzin)、黃豆苷元 (daidzein)、黃豆黃素苷 (gly2 citin)和黃豆黃素 (glycitein)。皂化很容易完成,取適量待測(cè)樣品加 3 mL、2 mol/L的 NaOH溶液,用鋁箔封住塞和瓶頸,在室溫下震蕩錐形瓶 10 min即可。具體測(cè)定方法可參閱原文 [J.AOAC Int.84,1865(2001)]。建議大豆育種專家采用或參考 AOAC公布的大豆異黃酮檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法可以方便地測(cè)定大豆異黃酮總的含量和染料木苷類、黃豆苷類和黃豆黃素苷類異黃酮含量。如果分別以染料木苷類和黃豆苷類異黃酮為大豆異黃酮育種的評(píng)價(jià)指標(biāo),只需要染料木苷、染料木黃酮、黃豆苷和黃豆苷元 4種標(biāo)準(zhǔn)品即可。

綜上所述,染料木黃酮和黃豆苷元是大豆異黃酮的活性因子,建議大豆異黃酮育種專家分別以染料木苷類異黃酮含量和黃豆苷類異黃酮含量作為育種的評(píng)價(jià)指標(biāo);因?yàn)?AOAC公布的檢測(cè)方法不需要高檔次儀器,且僅需少量的大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品,所以建議采用AOAC公布的大豆異黃酮的檢測(cè)方法。

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Evaluation Indexes and DetectionMethods in Breeding of Soybean Isoflavones

Zhang Yongzhong1,2Xu Jing1
(College of Science,NortheastAgriculturalUniversity1,Harbin 150030)
(Key Laboratory of Soybean Biology,Ministry of Education2,Harbin 150030)

The evaluation index of the breeding of soybean isoflavones now adopted is the total isoflavone con2 tent in species,and the detection method used is high perfor mance liquid chromatography orUV spectrophotometry.Chemical structure deter mines biological activity.A variety of soy isoflavone monomers have different biological activ2 ities,and they have different strength of biological activity.W ith the development of scientific research,the evalua2 tion index and detection method also need i mprovement to be more suitable formodern scientific progress.The evalu2 ation index and detection method of the breeding of soybean isoflavones are briefly introduced in this article.Genistin and daidzin contents in soybean isoflavones are recommended as breeding evaluation indexes for the breeding,and AOAC methods should be adopted in the soybean isoflavone deter mination.

soybean isoflavones,breeding,evaluation index,AOAC detection method

TS201.1

A

1003-0174(2011)01-0044-05

863計(jì)劃(2008AA10Z331)

2010-02-01

張永忠,男,1953年出生,教授,碩士生導(dǎo)師,天然產(chǎn)物化學(xué)