兩步水解酶法制備大豆異黃酮苷元初探

錢麗麗 左 鋒 張愛武 張永忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1,大慶 163319)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院2,哈爾濱 150030)

(國家教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3,哈爾濱 150030)

兩步水解酶法制備大豆異黃酮苷元初探

錢麗麗1左 鋒1張愛武1張永忠2,3

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1,大慶 163319)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院2,哈爾濱 150030)

(國家教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3,哈爾濱 150030)

利用二步水解法制備大豆異黃酮苷元。經(jīng)弱堿水解丙二?；蠖巩慄S酮為糖苷型大豆異黃酮,再經(jīng)果膠酶進(jìn)一步水解獲得富含苷元的大豆異黃酮。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),得到果膠酶制備大豆異黃酮苷元的較優(yōu)工藝條件:果膠酶水解時(shí)間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質(zhì)量比為0.80%。苷元水解得率為 87.37%。

果膠酶 染料木黃酮 黃豆苷元

隨著人類對(duì)大豆異黃酮的生物學(xué)意義的不斷研究,大豆異黃酮苷元的生理作用[1-3]和人體吸收形式更加明確化,從而國內(nèi)學(xué)者越來越多關(guān)注大豆異黃酮苷元制備的研究,目前已見研究中的葡萄糖苷酶水解制備苷元研究[4-5],但由于此種酶尚未商業(yè)化,因此制約了大豆異黃酮苷元制備的工業(yè)化,試驗(yàn)首次應(yīng)用果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮制備大豆異黃酮苷元。大豆中的大豆異黃酮主要以糖苷形式存在,其中丙二?；痛蠖巩慄S酮占總的大豆異黃酮含量的60%之多。因此制備富含苷元形式的大豆異黃酮需要對(duì)糖苷形式的大豆異黃酮進(jìn)行水解。水解分為兩步,第一步是將丙二?；痛蠖巩慄S酮水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖苷型大豆異黃酮,第二步是將葡萄糖苷型大豆異黃酮水解成大豆異黃酮苷元,以最大限度獲得高含量的大豆異黃酮苷元。對(duì)丙二?；痛蠖巩慄S酮水解制備葡萄糖苷型大豆異黃酮已進(jìn)行研究[6],而對(duì)于糖苷型到苷元型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化采取果膠酶水解法制備大豆異黃酮苷元,試驗(yàn)在前期的基礎(chǔ)上進(jìn)行第二步酶水解法,通過單因素和正交試驗(yàn)確定較優(yōu)工藝條件,最大限度獲得富含苷元大豆異黃酮,為解決酶法制備高活性大豆異黃酮的工業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

黃豆苷 (Daidzin,D)、黃豆苷元 (Daidzein,De)、染料木苷 (Genistin,G)、染料木黃酮 (Genistein,Ge):Sigma公司。果膠酶:杰諾生物酶有限公司 (經(jīng)測(cè)定酶比活力為:29 812 U/mg)。豆粕 (東農(nóng) 32):東北農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。30%大豆異黃酮粉:哈高科贈(zèng)送。試驗(yàn)所用甲醇為色譜級(jí),其余試劑為分析純。

CX-500型超聲波清洗機(jī):北京醫(yī)療設(shè)備二廠;LG10-2.4A型高速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;H.H.S 21-2R型電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠;ZFQ85A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海醫(yī)械專機(jī)廠;P680戴安高效液相色譜儀:美國戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆異黃酮含量測(cè)定

高效液相分析條件:

流動(dòng)相:甲醇 ∶乙酸 (0.5%)=40∶60(體積比 ),色譜柱:Nova-Pak C18(3.9×150mm),柱溫:50℃,流速:1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm,進(jìn)樣量:10μL。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷各自性質(zhì)不同,經(jīng)紫外檢測(cè)器測(cè)定,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品比較,以保留時(shí)間定性、峰面積定量、外標(biāo)法計(jì)算。

果膠酶水解制得大豆異黃酮苷元得率的測(cè)定:

1.2.2 大豆異黃酮提取液的制備

采用脫脂豆粕作為原料,稱量脫脂豆粕 (過 40目篩)1.0 g,80%乙醇浸提劑 10 mL,60℃水浴振蕩3 h,調(diào)等電點(diǎn) pH 4.5,3 000 r/min離心 10 min,上清液為大豆異黃酮提取液。

1.2.3 一步弱堿水解丙二酰基大豆異黃酮制備富含糖苷型大豆異黃酮

從脫脂豆粕中大豆異黃酮提取液,加入稀堿液調(diào) pH 11.0,于 65℃水浴振蕩 1 h,此過程可將丙二?；痛蠖巩慄S酮轉(zhuǎn)化為糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá) 90%以上。

1.2.4 果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的工藝路線

用果膠酶在適合條件下進(jìn)行大豆異黃酮酶水解的研究,以酶水解后大豆異黃酮苷元含量增加為指標(biāo)判定酶的選擇依據(jù),果膠酶水解工藝如下:

大豆異黃酮提取液→弱堿水解[5]→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙醇→加入醋酸鹽緩沖液→果膠酶解→酶滅活→冷卻→乙酸乙酯萃取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙酸乙酯→丙酮溶解→離心→上清液→蒸去丙酮→乙醇溶解定容→膜過濾→HPLC測(cè)定大豆異黃酮各組分含量。

以下試驗(yàn)均做 3次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果以平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 果膠酶單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 時(shí)間對(duì)果膠酶水解大豆異黃酮糖苷的影響

按 1.2.2和 1.2.3方法制備獲得富含糖苷型大豆異黃酮制備液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,醋酸 -醋酸鈉溶液調(diào) pH至 4.0緩沖液 100 mL,加酶量按酶 -底物質(zhì)量比為 0.8%計(jì)算,在 45℃下分別水浴振蕩水解15、30、45、60、120 min和過夜。經(jīng) HPLC檢測(cè)大豆異黃酮苷元水解得率為指標(biāo),確定水解時(shí)間。

1.2.5.2 溫度對(duì)果膠酶水解大豆異黃酮糖苷的影響

按 1.2.5.1方法分別在 40、45、50、55和 60℃下水浴振蕩水解 30 min。經(jīng) HPLC檢測(cè)大豆異黃酮苷元水解得率為指標(biāo),確定水解溫度。

1.2.5.3 pH對(duì)酶水解得率的影響

按 1.2.5.1方法分別用醋酸 -醋酸鈉溶液調(diào) pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0,加酶 -底物質(zhì)量比為 0.8%,在 50℃下水浴振蕩水解 30 min。經(jīng)HPLC檢測(cè)大豆異黃酮苷元水解得率為指標(biāo),確定水解 pH值。

1.2.5.4 不同酶 -底物濃度比對(duì)酶水解得率的影響

按 1.2.5.1方法分別加酶 -底物質(zhì)量比為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,在 50℃下水浴振蕩水解 30 min。經(jīng) HPLC檢測(cè)大豆異黃酮苷元水解得率為指標(biāo),確定水解酶 -底物質(zhì)量比。

1.2.6 果膠酶正交試驗(yàn)確定酶水解條件

正交試驗(yàn)因素水平表見表 1。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 果膠酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的研究

2.1 果膠酶單因素試驗(yàn)

2.1.1 時(shí)間對(duì)果膠酶水解得率的影響

由圖 1可知,果膠酶水解時(shí)間起初隨著時(shí)間的延長(zhǎng),苷元水解得率迅速上升,在 30 min時(shí)水解苷元得率最高,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),水解得率降低后稍有增高,這主要是豆粕自身葡萄糖苷酶也參與了水解的結(jié)果。

圖 1 果膠酶水解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.2 不同果膠酶 -底物質(zhì)量比對(duì)酶水解得率的影響

由圖 2可知,隨著添加果膠酶 -底物質(zhì)量比不斷增加,苷元水解得率也不斷迅速增加,當(dāng)增加到0.8%時(shí)大豆異黃酮苷元水解得率較高。

圖 2 果膠酶不同酶 -底物質(zhì)量比對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.3 pH對(duì)果膠酶水解得率的影響

由圖 3可知,pH值為 4.0時(shí),大豆異黃酮大豆異黃酮水解程度最大,苷元的水解得率最高。pH在3.5時(shí)對(duì)果膠酶的水解作用起到一定的抑制。

圖 3 pH對(duì)果膠酶水解大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2.1.4 溫度對(duì)果膠酶水解得率的影響

由圖 4可以看到,溫度對(duì)酶水解大豆異黃酮較為敏感,當(dāng)溫度在 45℃果膠酶酶比活力最大,水解得率也最高。大于 50℃后苷元水解得率迅速減小,與溫度對(duì)果膠酶的比活力有關(guān)。

圖 4 溫度對(duì)果膠酶水解大豆異黃酮苷元得率的影響

2.2 果膠酶正交試驗(yàn)

在各種試驗(yàn)單因素條件下,選擇各種酶影響因素的最佳條件,制定正交試驗(yàn)方案,結(jié)果見表 2。

表 2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

由極差分析結(jié)果可以看出影響果膠酶水解效率的主次因素依次為B>A>D>C。最佳水解條件為A1B3C3D2,即果膠酶水解時(shí)間 20 min,水解溫度47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質(zhì)量比為 0.80%。

2.3 二步法水解制備富含苷元大豆異黃酮粉

利用上述較優(yōu)條件制備富含苷元的大豆異黃酮粉,采用豆粕和 30%的大豆異黃酮粉為原料,在弱堿條件下進(jìn)行丙二?；痛蠖巩慄S酮到糖苷型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化,再進(jìn)行工業(yè)化酶果膠酶的水解,多次萃取,回收溶劑干燥后得到富含苷元的大豆異黃酮。經(jīng) HPLC檢測(cè)苷元含量及產(chǎn)率見表 3。水解前后樣品色譜圖見圖 5～圖 7。

表 3 二步法水解制備大豆異黃酮苷元

由表 3可以看出,果膠酶水解豆粕 10 g后得到黃豆苷元為 1.15 mg,染料木黃酮為 2.88 mg。水解30%異黃酮粉得到黃豆苷元為 112 mg,染料木黃酮為97.7 mg。

圖 7 果膠酶水解后樣品色譜圖

從圖 5～圖 7可見,由峰出現(xiàn)的先后順序檢測(cè)物質(zhì)依次為:溶劑峰、黃豆苷 D、染料木苷 G、丙二酰基黃豆苷MD、丙二酰基染料木苷 MG、黃豆苷元 De、染料木黃酮 Ge,經(jīng)弱堿水解后MD、MG峰基本消失而轉(zhuǎn)化為黃豆苷和染料木苷,該部分內(nèi)容已在作者前期研究文獻(xiàn)中加以研究,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行果膠酶水解,可見在果膠酶水解時(shí)間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解 pH值 4.2,酶 -底物質(zhì)量比為0.80%條件下,水解后黃豆苷元 De和染料木黃酮 Ge峰明顯增加,水解后苷元水解得率達(dá)到87.37%,黃豆苷和染料木苷峰明顯減小,說明果膠酶水解糖苷鍵效果明顯。

3 結(jié)論

在前期弱堿水解丙二?；痛蠖巩慄S酮的基礎(chǔ)上,通過不同酶制備富含苷元的大豆異黃酮中,初步確認(rèn)果膠酶具有水解制備大豆異黃酮苷元的作用,由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出采用果膠酶水解糖苷形式大豆異黃酮為苷元形式大豆異黃酮較優(yōu)條件為:果膠酶水解時(shí)間 20 min,水解溫度 47.5℃,水解pH值 4.2,酶 -底物質(zhì)量比為 0.80%。通過二步法制得富含苷元形式的大豆異黃酮。脫脂豆粕產(chǎn)品產(chǎn)率為 0.67%,總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6.03%;30%大豆異黃酮粉獲得產(chǎn)品產(chǎn)率為 18.6%,總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.56%。

[1]張永忠,孫艷梅.大豆異黃酮研究中的名詞術(shù)語[J].中國糧油學(xué)報(bào),2004(4):46-49

[2]Kritz-Silverstein D and Goodman-Gruen DL.Usual dietary isoflavone intake,bone mineral density,and bone metabolism in Postmenopausal Women.Womens Health Gend.Based Med.2002,11(1),69-78

[3]Ghosh P and Fenner GP.I mproved method for gas chromato2 graphic analysis of genistein and daidzein from soybean(gly2 cine max)seeds.Agric.Food Chem,1999,47(9)3455-3456

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[5]許晶,孫艷梅.里氏木霉 -葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的工藝研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2009,24(3):31-34

[6]張愛武,張永忠,錢麗麗,等.弱堿水解丙二?；痛蠖巩慄S酮的研究[J].中國食品工業(yè),2006(12):52-53.

Transfor ming Soybean IsoflavonesAglycon by Enzyme in T wo-Step Hydrolysis

Qian Lili1Zuo Feng1Zhang Aiwu1Zhang Yongzhong2,3
(College of Food Science,August-firstLand Reclaim University1,Daqing 163319)
(College of Science,ScienceNortheastAgricultureUniversity2,KeyLaboratory of Soybean Biology ofNational Ministry of Education3,Harbin 150030)

Aglycon preparation of soybean isoflavones by two hydrolysis processwas studied.Transformingmal2 onylisoflavones to glucosides by alkalescent hydrolysis,then soybean isoflavones aglycon wasobtained by further pecti2 nase hydrolysis.Through the single factor experiment and orthogonal experiment,the following best condition of pecti2 nase hydrolysiswas obtained:enzymatic hydrolysis time 20 min,temperature 47.5℃,pH 4.2,and enzyme dosage 0.80%.The aglycon hydrolysis rate was 87.37%.

pectinase,genistein,aglycon

TS218

A

1003-0174(2011)02-0014-04

黑龍江省“十一五”重大科技攻關(guān)專項(xiàng)大豆綜合加工關(guān)鍵技術(shù)研究與開發(fā)(GA06B402-4)

2010-02-06

錢麗麗,女,1979年出生,講師,天然保健功能因子開發(fā)

張永忠,男,1953年出生,教授,食品化學(xué)