中國(guó)大豆核心種質(zhì)異黃酮含量的分析

袁鳳杰 姜 瑩 董德坤 朱丹華 李百權(quán) 朱申龍 付旭軍

(浙江省農(nóng)科院作物與核技術(shù)利用研究所 國(guó)家大豆改良杭州分中心,杭州 310021)

中國(guó)大豆核心種質(zhì)異黃酮含量的分析

袁鳳杰 姜 瑩 董德坤 朱丹華 李百權(quán) 朱申龍 付旭軍

(浙江省農(nóng)科院作物與核技術(shù)利用研究所 國(guó)家大豆改良杭州分中心,杭州 310021)

應(yīng)用大豆核心種質(zhì)庫(kù)中的部分夏秋種質(zhì),分析了不同品種、省份和生態(tài)類型之間,總異黃酮含量和 12種異黃酮組分含量的差異。結(jié)果表明:不同品種間總異黃酮含量差異較大,參試所有品種總異黃酮含量集中分布在 1 000～4 000μg/g之間;發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)總異黃酮含量大于 5 000μg/g的品種。將 12種不同的異黃酮組分劃分為 4大類進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)不同品種間異黃酮組分含量差異顯著;大豆異黃酮主成分與總異黃酮含量具有良好的正相關(guān)。比較不同省份和生態(tài)地區(qū)的總異黃酮含量和組分含量,發(fā)現(xiàn)不同省份之間總異黃酮含量存在顯著的差異。總體來(lái)說(shuō),黃淮海區(qū)域省份內(nèi)大豆的異黃酮總含量顯著高于南方省份內(nèi)大豆的異黃酮總含量;夏大豆類型品種的總異黃酮含量顯著高于秋大豆類型品種。大豆異黃酮的主要組成成分黃豆黃素苷和染料木苷的含量在不同省份之間差異顯著;黃豆黃素苷和黃豆苷在不同生態(tài)類型之間具有較為顯著的差異。

大豆 總異黃酮 異黃酮組分 省份 生態(tài)類型

大豆不僅可以為人類提供優(yōu)質(zhì)蛋白和油脂,而且還含有豐富的生理活性物質(zhì),如大豆異黃酮、低聚糖、大豆皂苷和大豆磷脂等,這些活性物質(zhì)在人們的健康保健以及抗病等方面發(fā)揮著積極的作用。大豆異黃酮具有抗癌、抗氧化、防止骨質(zhì)疏松、抗心血管疾病和緩解更年期綜合癥等功能[1-2]。大豆異黃酮是一種多酚類的混合物,是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。迄今為止,從大豆中共分離出 12種大豆異黃酮異構(gòu)體,分為游離型苷元 (Aglycons)和結(jié)合型糖苷 (Glucosides)兩類,其中苷元占總量的 2%～3%,包括染料木素 (Genistein)、大豆苷元(Daidzein)和黃豆黃素 (Glycitein)3種。結(jié)合型糖苷由 3種苷元衍生而成,占總量 97%～98%,主要以染料木苷 (Genistin)、大豆苷 (Daidzin)和 6″-O-丙二酰基染料木苷 (6″-O-Maloylgenistin)等 9種形式存在[3]。

不同大豆品種其異黃酮含量存在明顯的差異,如美國(guó)大豆品種比日本大豆品種異黃酮總量高[4],北方春大豆品種異黃酮含量比南方春大豆品種高[5]。此外產(chǎn)地、生產(chǎn)年份、生態(tài)類型和氣候條件等大豆異黃酮含量也具有顯著的影響[6-8]。本研究應(yīng)用具有廣泛代表性的我國(guó)大豆核心種質(zhì)庫(kù)中的部分夏秋大豆資源,對(duì)其總異黃酮含量和不同異黃酮組分進(jìn)行了分析測(cè)定,明確這部分核心種質(zhì)異黃酮含量的變異范圍,鑒定高異黃酮含量的核心種質(zhì)資源,以用于高異黃酮等優(yōu)質(zhì)品種的選育。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

300份大豆種質(zhì)中,部分為夏秋大豆核心種質(zhì),引自中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù),部分種質(zhì)來(lái)自于杭州國(guó)家大豆改良分中心種質(zhì)庫(kù)。種質(zhì)于 2006年夏種植于浙江省農(nóng)科院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。所有品種按小區(qū)種植,成熟后收獲種子,風(fēng)干,密閉于 -20℃冰箱內(nèi)保存待用。其供試品種的原產(chǎn)地、生態(tài)類型和供試份數(shù)見(jiàn)表 1。

12種異黃酮組分標(biāo)樣 (黃豆苷、黃豆黃素苷、染料木苷、丙二酰黃豆苷、丙二酰黃豆黃素苷、丙二酰染料木苷、乙?；S豆苷、乙?；S豆黃素苷、黃豆苷元、黃豆黃素苷元、乙?；玖夏拒?和染料木苷元):美國(guó) Sigma公司。Agilent 110高效液相色譜:美國(guó)安捷倫公司。

表 1 參試品種基本信息表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

取 50 g種子于 60℃烘干 72 h,然后使用手提式高速中藥粉碎機(jī)磨粉,過(guò) 60目篩,保存于干燥器中備用。

1.2.2 異黃酮的提取及測(cè)定

取 0.5 g大豆粉加入 2 mL甲醇和 0.l mol/L鹽酸的混合液 (3∶1),180 r/min充分震蕩 2 h,取 1.5 mL混合液于離心管中,10 000 r/min離心 10 min,取上清液,用 0.45μm的油性過(guò)濾頭過(guò)濾至上樣瓶中,高效液相色譜 (HPLC)分析異黃酮以及其組分的含量。其中流動(dòng)相 A為 0.1%三氟乙酸水溶液,B為0.1%的三氟乙酸乙啨溶液,流動(dòng)體系為 (A%/B%):14 min(71/29),18 min(70/30),24 min(58/42),34 min(100/0),流速為 1 mL/mi m,進(jìn)樣品量為5μL,柱溫 37℃。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行定性,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)峰峰面積確定樣品中異黃酮各組分的含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

方差分析和多重比較數(shù)據(jù)應(yīng)用 SAS9.0軟件進(jìn)行分析;總異黃酮和單一異黃酮組分的變異分析應(yīng)用Excel 2000。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆種質(zhì)總異黃酮含量的分析

用 HPLC對(duì)參試材料進(jìn)行總異黃酮含量分析,發(fā)現(xiàn)不同品種之間總異黃酮含量差異較大,參試所有品種總異黃酮平均含量為 2 393.17μg/g,其含量集中分布在 1 000～4 000μg/g之間 (圖 1);其中異黃酮含量最高品種為廣西夏大豆品種響水黑豆(ZDD17256)6 068.92μg/g,含量最低的為浙江蘭溪秋大豆大青豆 (ZDD06322),其異黃酮含量?jī)H為180.23μg/g?？偖慄S酮含量大于 5 000μg/g的品種有 5個(gè),分別為:醬黃豆 (ZDD10812,陜西)、小紅楂豆 (ZDDZ03076,山東 )、刺猬子黃豆 (ZDD11697,湖北)、74-424(ZDD11588,湖北 )和響水黑豆(ZDD17256,廣西),分布在 4個(gè)不同的省份?？偖慄S酮含量小于 1 000μg/g的品種共 6份,分別為:大青豆 (ZDD06322,浙江)、石芽黃 (ZDD17227,廣西 ),遲黃豆 1(ZDD12023,湖北),小花豆 (ZDD11467,安徽)、禾亭藥豆 (ZDD14770,湖南)和平頂黃(ZDD02710,山東),分布在 6個(gè)不同的省份。

圖 1 參試品種總異黃酮含量分布圖

2.2 大豆種質(zhì)異黃酮組分含量的分析

應(yīng)用 HPLC方法可以將 12種不同的異黃酮組分清晰的分開,各種組分的保留時(shí)間和大致含量如圖 2所示。

圖 2 大豆異黃酮組分的保留時(shí)間和含量的 HPLC圖

分析結(jié)果表明:與總異黃酮含量的結(jié)果相似,不同品種之間各異黃酮組分含量存在及其較大的差異。其中大豆異黃酮主要成分黃豆苷變異范圍為8.61～779.26μg/g,丙二酰型黃豆苷變異范圍為38.33～2 483.08μg/g,丙二酰型染料木苷變異范圍為83.01～3 343.75μg/g,染料木苷變異范圍 10.03～510.42μg/g(表 2)。主要抗癌活性成分染料木苷元和黃豆黃素苷元的最高含量為 98.47和 20.06μg/g(表 2)。分析總異黃酮含量和不同組分的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)主要成分黃豆苷,丙二酰黃豆苷,丙二酰染料木苷和染料木苷與總異黃酮含量的相關(guān)性均達(dá) 80%以上,主要活性成分染料木苷元與總異黃酮含量的相關(guān)性也達(dá)到 86%,總異黃酮含量高的品種其活性成分含量也較高 (表 2)。

表 2 大豆核心種質(zhì)資源異黃酮組分含量分析一覽表/μg/g

12種異黃酮組分分析發(fā)現(xiàn):大豆異黃酮主要以丙二?；偷狞S豆苷、黃豆黃素苷和染料木苷的形式存在;而苷元類在大豆中所占的比例極低,在很多品種中,某些苷元的成分幾乎檢測(cè)不到。在丙二?；偷?3種成分中,丙二酰黃豆苷與丙二酰染料木苷與總異黃酮含量的相關(guān)性達(dá)到 80%以上,而丙二酰黃豆黃素苷與總異黃酮含量幾乎沒(méi)有相關(guān)關(guān)系。

2.3 不同省份和生態(tài)類型之間總異黃酮含量的比較分析

對(duì) 17個(gè)省份之間核心種質(zhì)大豆異黃酮總量進(jìn)行多重比較和方差分析 (見(jiàn)表3、表4),發(fā)現(xiàn)不同省份之間大豆品種中的異黃酮含量存在顯著的差異;其中河南省大豆品種中異黃酮含量最高,顯著高于其他省份,包括河南、河北、湖北、江蘇、山東和陜西省黃淮海夏大豆區(qū)域種質(zhì)的異黃酮含量明顯偏高與南方區(qū)域的夏秋大豆品種,但廣西省 5個(gè)樣品的大豆異黃酮平均含量?jī)H次于河南省,明顯高于南方其他省份的大豆含量;而位于黃淮區(qū)域內(nèi)的安徽省大豆異黃酮含量則明顯低于黃淮區(qū)域內(nèi)的其他省份。

表 3 不同省份大豆品種異黃酮組分的統(tǒng)計(jì)分析及多重比較/μg/g

表 4 不同省份大豆異黃酮總含量及其組分含量的方差分析

對(duì)樣本中的夏、秋兩個(gè)不同生態(tài)類型的大豆異黃酮含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)類型之間存在顯著的差異,夏大豆品種異黃酮含量顯著高于秋大豆 (表 5)。

表 5 不同生態(tài)類型之間異黃酮總量的方差分析

2.4 不同省份和生態(tài)類型之間異黃酮組分含量的比較分析

由表 3、表 4可知,方差分析表明:黃豆黃素苷類和染料木苷類在不同省份之間含量差異顯著,而黃豆苷類在各省份之間含量無(wú)顯著差異。將不同省份的種質(zhì)異黃酮組分含量進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn):河南省的種質(zhì)中異黃酮組分含量均處于前 5位;江蘇、廣西、河北和山東省的異黃酮組分含量均較高,而甘肅、上海、云南和安徽省的異黃酮組分含量較低,處于 17個(gè)省的最后幾位,該結(jié)果與異黃酮總含量一致。

由表 5可知,不同生態(tài)類型之間,夏大豆類型的黃豆苷類和黃豆黃素苷類顯著高于秋大豆類型,而染料木苷和苷元類在不同生態(tài)類型之間無(wú)顯著差異。

3 討論和結(jié)論

隨著對(duì)大豆異黃酮生理功能的深入認(rèn)識(shí),培育高異黃酮含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種已成為育種家的共識(shí);對(duì)品種資源進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)而篩選出高異黃酮含量的種質(zhì)資源是為高異黃酮育種提供親本材料和理論依據(jù)的重要基礎(chǔ)研究工作。本研究應(yīng)用核心種質(zhì)庫(kù)中 17個(gè)省份中的夏秋大豆種質(zhì)異黃酮總量和組分含量進(jìn)行了評(píng)價(jià),核心種質(zhì)代表了廣泛的變異和遺傳多樣性,對(duì)這些種質(zhì)資源進(jìn)行各種性狀和品質(zhì)指標(biāo)的評(píng)價(jià),豐富他們的各種信息,對(duì)于核心種質(zhì)的應(yīng)用具有極大的推動(dòng)作用。

研究發(fā)現(xiàn),在這些核心資源中異黃酮總含量和組分含量存在廣泛的變異,這與核心種質(zhì)所代表的廣泛的變異性是相符的,與以往所報(bào)道的研究結(jié)果也比較一致[9];所發(fā)現(xiàn)的高異黃酮品種和低異黃酮品種分別分布在不同的省份,說(shuō)明在我國(guó)各個(gè)大豆栽培省份都極有可能篩選出高異黃酮含量和低異黃酮含量的特用種質(zhì),開展高異黃酮含量的優(yōu)質(zhì)育種工作具有良好的基礎(chǔ)。

對(duì)異黃酮組分含量進(jìn)行了分析和比對(duì),發(fā)現(xiàn)盡管大豆異黃酮中的部分主成分與總異黃酮含量存在較高的相關(guān)性,但仍有一些主要的成分如:丙二酰黃豆黃苷和黃豆黃素苷與總異黃酮含量的相關(guān)關(guān)系不足 60%,而乙?；狞S豆苷和染料木苷與總異黃酮含量的相關(guān)性更低;說(shuō)明在對(duì)某個(gè)組分的含量進(jìn)行選擇時(shí),不能僅憑總異黃酮含量的高低來(lái)評(píng)判,某些總異黃酮含量低的品種某些組分的含量可能較高。在分析異黃酮組分時(shí),發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮主要以黃豆苷、染料木苷和丙二酰基化的黃豆苷、染料木苷的形式存在,游離型苷元的含量極低,這與前人的研究報(bào)道結(jié)果也比較一致[8]。

不同生態(tài)類型大豆異黃酮含量和組分存在明顯的差異,夏大豆品種中異黃酮含量顯著高于秋大豆品種,黃淮區(qū)域的大豆資源異黃酮含量顯著高于南方區(qū)域的大豆資源,這與以往的報(bào)道也基本一致[6,10];但其中廣西省的大豆異黃酮含量總體表現(xiàn)出較高的趨勢(shì),這可能和所選用的樣本量較小有關(guān),擴(kuò)大廣西省的試驗(yàn)樣本量將更能如實(shí)反映該地區(qū)大豆異黃酮含量的變異情況,但就本研究的結(jié)果來(lái)看,該地區(qū)大豆異黃酮含量明顯高于其他南方各省。

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Analysis of Isoflavone Content in Soybean Core Collection

Yuan Fengjie Jiang Ying Dong Dekun Zhu Danhua LiBaiquan Zhu Shenlong Fu Xujun
(Institute of Crop Science and Nuclear Technology Utilization/Hangzhou National Soybean Improvement Sub-center,ZhejiangAcademy ofAgricultural Sciences,Hangzhou 310021)

300 summer and autumn soybean varieties from core collection were tested to compare their total isoflavone content and isoflavone component contents among different varieties,provinces and ecotypes.Results:There are significant differences for total isoflavone content among different varieties;the isoflavone contentsofmost varieties are in the range of 1 000～4 000μg/g,5 varieties have isoflavone contents over 5 000μg/g.Isoflavone compositions are also significantly different among different varieties.There are high correlations between total isoflavone content and major isoflavone components.Total isoflavone contents are significantly different among different provinces,and the total isoflavone contents in soybean varieties from Huang HuaiHai area are higher than those from South of China.Summer soybean varieties have higher total isoflavone content than autumn soybean varieties.The contents of major isoflavone components Glycitin groups and Genistin groups are significantly different among different provinces,and the contents of Glycitin groups and Daidzin groups are different among different ecotypes.

soybean,total isoflavone,isoflavone composition,province,ecotype

S565.1

A

1003-0174(2011)02-0005-05

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃 (2004CB 117203),浙江省科技廳公關(guān)項(xiàng)目(2005R16 A50B01)

2010-03-10

袁鳳杰,女,1971年出生,副研究員,博士,大豆種質(zhì)資源創(chuàng)新與新基因發(fā)掘