高效液相色譜法測定康婦舒軟膠囊中鹽酸小檗堿的含量

高亞雄，楊興鑫，張曉霞，暢瑞苗，李曉妮 (山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，太原 03000;山西醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室;通訊作者，E-mail:ninili35@63.com)

康婦舒軟膠囊來源于臨床經(jīng)驗方，由黃柏、白芍苦參、雞血藤、桃仁、紅花、益母草、龍膽草及澤瀉多味中藥材組成，具有清熱燥濕，活血化瘀，調(diào)經(jīng)止帶之功效，臨床上主要用于宮頸炎、陰道炎、月經(jīng)不調(diào)、赤白帶下、痛經(jīng)、附件炎等疾病的治療，效果良好。方中黃柏為君藥，具有清熱燥濕，瀉火解毒，退虛熱的功效［1］，現(xiàn)代藥理學研究表明，黃柏具有多方面藥理作用，主要包括抗菌、抗真菌、抗滴蟲以及免疫抑制作用等［2］，其主要成分是鹽酸小檗堿［3］。為有效控制康婦舒軟膠囊的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜建立了測定該制劑中鹽酸小檗堿含量的方法。實驗結果表明，該方法準確度高、重現(xiàn)性好，可作為康婦舒軟膠囊的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp型輸液泵，SPD-10Avp型紫外－可見光檢測器，LC色譜工作站);鹽酸小檗堿對照品(批號:110713－200208，純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈(山東禹王實業(yè)有限公司)為色譜純，水為三次蒸餾水;其余試劑均為分析純;康婦靈軟膠囊(山西醫(yī)科大學藥學院藥物分析實驗室自制，規(guī)格為每粒0.8 g，批 號 分 別 為 20100427，20100428，20100429，20100513，20100514，20100515，20100516，20100517，20100518，20100519)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 經(jīng)過考察色譜填料、流動相組成、柱溫及流速對色譜分離的影響，最后確定最佳的色譜條件為:色譜柱 Alltima C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 ml含十二烷基磺酸鈉SDS 0.1 g);流速:1.0 ml/min;檢測波長:348 nm;柱溫:40℃;進樣量:20 μl。取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結果理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計不低于3 000，鹽酸小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離度不低于1.5，且陰性樣品無干擾，對照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。結果顯示，陰性對照在鹽酸小檗堿應該出峰的地方(箭頭所示)無其他雜質(zhì)成分的干擾，方法的專屬性強。

圖1 對照品(A)、樣品(B)、不含黃柏陰性樣品(C)色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatograms of reference substance(A)，sample(B)，and negative sample without cortex phellodendri chinensis(C)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.0 mg，置100 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50 μg/ml對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物約0.3 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚80 ml，加熱回流1 h，棄去石油醚液，藥渣揮去石油醚，置100 ml容量瓶中，加入流動相80 ml，超聲處理30 min，放冷，再用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 取除黃柏外的其余處方量藥材，按康婦靈軟膠囊制備方法制備缺黃柏的陰性樣品，按2.2.2項下方法操作，制成缺黃柏的陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察 取2.2.1項下溶液20 ml，用流動相稀釋到 100 ml，精密量取 1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10 ml分別至10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度對照品溶液。在2.1項下的色譜條件下進樣測定，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖2)。鹽酸小檗堿的回歸方程為:Y=108 730X+9 363.7，r=0.999 8。結果表明:鹽酸小檗堿濃度在1－10 μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4 精密度試驗 取2.2.1項下對照品溶液，在2.1項下的色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算鹽酸小檗堿色譜峰面積的RSD為0.46%，表明精密度良好。

圖2 鹽酸小檗堿濃度標準曲線Fig 2 Standard curve of berberine hydrochloride between concentration and peak area

2.5 重復性試驗 取康婦舒軟膠囊樣品(批號為20100429)，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，依法進樣測定，計算鹽酸小檗堿的平均含量為1.53 mg/粒，RSD 為1.17%，表明重復性好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0，3，6，9，12 h進樣，測定峰面積。鹽酸小檗堿色譜峰面積的RSD為0.66%。結果顯示，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗 精密稱取鹽酸小檗堿對照品2.54 mg，加流動相制成濃度為 0.254 mg/ml的溶液，分別精密移取1 ml加入到已知含量(批號為20100429)的6份樣品中，按2.2.2項下方法制備溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表1。結果表明，鹽酸小檗堿的平均回收率為100.46%(RSD=2.34%)，回收率滿足分析要求，方法準確。

2.8 樣品測定 取10批康婦舒軟膠囊，按2.2.2項下的方法處理后進樣，記錄峰面積，以外標法計算康婦舒軟膠囊中鹽酸小檗堿的含量，結果見表2。10批樣品含量測定結果表明，康婦舒軟囊中鹽酸小檗堿的含量不應低于1.21 mg/粒。

表1 鹽酸小檗堿的加樣回收率實驗結果 (n=6)Tab 1 Results of recovery test of berberine hydrochloride by HPLC (n=6)

表2 10批樣品中鹽酸小檗堿含量的測定結果 (n=5)Tab 2 Quantitative analysis results of berberine hydrochloride in 10 batches of samples (n=5)

3 討論

3.1 提取時間和溶劑用量對提取效果的影響 本文考察不同提取時間(20，30，40，60 min)對鹽酸小檗堿提取效果的影響，結果表明，隨著提取時間的延長，鹽酸小檗堿含量增加，當提取時間超過30 min后，含量增加程度很小，故確定超聲時間為30 min時提取效果最佳;此外，對不同的提取溶劑用量(50，80，100 ml)進行考察，結果表明，隨溶劑用量的增大，鹽酸小檗堿的含量逐漸增加，且溶劑用量為80 ml和100 ml時，鹽酸小檗堿的含量相當，故確定最佳的溶劑用量為80 ml。

3.2 流動相的選擇 考察了甲醇－水及乙腈 －水－三乙胺，考慮到保留時間、峰形及對柱效影響因素等，最后選擇乙腈－0.1%磷酸(50∶50)體系，流速1.0 ml/min，柱溫40℃，結果鹽酸小檗堿峰的保留時間為16.5 min，柱效高，峰形較好，分離度大于1.5。

3.3 檢測波長的選擇 在200－400 nm之間，取鹽酸小檗堿對照品進行紫外吸收掃描，結果表明在265 nm和348 nm處有兩個強吸收峰，參考相關文獻［4，5］，確定檢測波長為 348 nm。

3.4 小結 本實驗采用高效液相色譜法測定康婦舒軟膠囊中鹽酸小檗堿的含量，方法簡單快速、重復性好、準確度高的特點，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

［1］ 吳嘉瑞，張冰，張光敏.黃柏藥理作用研究進展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，9(11):160－162.

［2］ 侯小濤，戴航，周江煜.黃柏的藥理研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(2):498－500.

［3］ 胡俊青，胡曉.黃柏化學成分和藥理作用的現(xiàn)代研究［J］.當代醫(yī)學，2009，15(7):139－141.

［4］ 李寶明，何麗一.高效液相法測定制霉滅滴膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.藥物分析雜志，2000，20(2):128－129.

［5］ 張旭香，張興運，許志紅.薄層掃描法測定長安升白粒中小檗堿的含量［J］.中草藥，2002，33(7):619－621.