比索洛爾對心力衰竭兔心房肌細胞鉀通道表達的影響

李 溪，馬愛群，任京婷，王亭忠，韓 克，盧 群，卓小楨 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室/心血管離子通道病研究室，陜西省分子心臟病學(xué)重點實驗室，西安 710061;通訊作者，E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)時房性心律失常的發(fā)生率明顯升高，是心房纖顫(atrial fibrillation，AF)發(fā)生的主要原因之一，房性心律失常與心房的電重構(gòu)有關(guān)［1－3］。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)、快激活延遲整流鉀電流(rapidly activated delayed rectifier potassium current，IKr)、慢激活延遲整流鉀電流(slowly activated delayed rectifier potassium current，IKs)和內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current，IK1)是形成心肌動作電位的主要外向電流［2］。Ito是形成心房肌細胞動作電位復(fù)極的1期。Ito分為快成分Ito，f和慢成分Ito，s兩種。Ito，f的 α 亞基由 Kv4.3 編碼，而Ito，s的 α亞基由Kv1.4編碼。延遲整流鉀電流(delayed rectifier potassium current，IK)是心房肌動作電位復(fù)極的主要電流。IK分為IKr和IKs。IKr的α亞基由ERG編碼，IKs通道 α亞基由KvLQT1編碼，IKs通道的 β亞基由minK編碼。IK1主要參與心房肌靜息電位的形成，直接影響動作電位的平臺期，決定去極化反應(yīng)時間。多項研究結(jié)果顯示，β受體阻滯劑抗心律失常的作用機制之一是對離子通道的影響，從而起到防止心律失常的作用［4］。

離子通道表達的變化是離子通道重構(gòu)的分子基礎(chǔ)。因此我們以容量負荷聯(lián)合壓力超負荷心力衰竭兔為研究對象，觀察左房心肌細胞K+通道表達的變化，以探討心衰時房性心律失常發(fā)生的機制。同時觀察比索洛爾干預(yù)對K+通道表達的影響，以探討比索洛爾抗心律失常的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及心衰模型的構(gòu)建 選擇由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的新西蘭兔39只，均為雄性，體重 2.5－3.0 kg，常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)前經(jīng)心動超聲檢查排除心臟器質(zhì)性病變后，隨機分為假手術(shù)組(sham operation，SO組;n=10)、心衰組(heart failure，HF組n=15)和比索洛爾干預(yù)組(heart failure with bisoprolol，BF 組;n=14)。

按照以往文獻方法［5］制作容量聯(lián)合壓力超負荷心力衰竭兔模型。于耳緣靜脈給予戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，將兔固定于動物手術(shù)臺，取頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸動脈，將4F造影導(dǎo)管(Cordis，美國強生公司)末端連接壓力換能器(成都泰盟科技公司)，導(dǎo)管插入頸動脈，快速、反復(fù)通過主動脈瓣，直到脈壓(arterial pressure，AP)升高了50%以上，表示誘導(dǎo)主動脈瓣關(guān)閉不全成功，形成容量超負荷。術(shù)后每只給予青霉素8萬U/d連續(xù)肌注3 d。2周后通過腹主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)壓力超負荷。術(shù)前禁食24 h，麻醉同前。右側(cè)臥位，取左側(cè)肋緣中點，縱向切口，鈍性分離腹主動脈(左側(cè)腎動脈上)。用5F或6F造影導(dǎo)管緊貼腹主動脈，用4號手術(shù)線環(huán)扎，然后取出導(dǎo)管，形成腹主動脈50%狹窄。術(shù)后每只均給予青霉素8萬U/d，連續(xù)肌注7 d。假手術(shù)組兔在2次手術(shù)中，只分離和結(jié)扎右側(cè)頸動脈及鈍性分離腹主動脈，術(shù)后處理同心力衰竭組。比索洛爾干預(yù)組，則是在誘導(dǎo)主動脈瓣關(guān)閉不全術(shù)后第2天給予比索洛爾(富馬酸比索洛爾，康忻，德國默克)1 mg/(kg·d)灌胃6周，其余處理同心力衰竭組。

1.2 心功能檢測 手術(shù)后8周分別通過以下檢查評估心功能。①心動超聲檢測。用美國惠普公司的HP Sonos 2500型多功能超聲檢查儀及7.5 MHz相控陣探頭檢測左房內(nèi)徑(left atrium diameter)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular diastolic diameter，LVDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular systolic diameter，LVSD)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，EF)、舒張早期二尖瓣血流速度E峰與舒張晚期血流速度A峰比值(E/A比值)、短軸速率(fraction shortening，F(xiàn)S)。②血清腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)測定。由腹主動脈抽取動脈血，EDTA抗凝，3 000 r/min離心10 min，取血清，用西唐生物公司兔腦鈉肽ELISA試劑盒檢測。③心體比等指標。麻醉同前，打開腹腔、胸腔，觀察有無積水，迅速取出心臟，用4℃PBS沖去殘血，濾紙吸干稱重，計算心臟、左室、肺臟與體重比。心房組織用液氮速凍后，轉(zhuǎn)至－80℃保存。

1.3 反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR檢測 TRIZOL(Sigma，美國)提取3組兔心房組織的總RNA，經(jīng)過純度檢測A260/A280在1.8－2.0之間，符合 RNA 樣品檢測要求。按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))進行cDNA合成。

以 NCBI Genebank提供的兔的 GAPDH、Kir 2.1、Kv4.3、Kv1.4、KvLQT1 minK、ERG 的 cDNA 序列為模板，由北京奧科生物公司合成引物(見表1)。按照TaKaRa real-time PCR試劑盒操作，采用兩步法PCR擴增程序:第一步，預(yù)變性:95℃ 10 s，1個循環(huán);第二步，PCR反應(yīng):95℃ 5 s，60℃(各個目的基因的核酸解鏈溫度)30 s，50個循環(huán)，擴增曲線完畢后，自動生成溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后確認realtime PCR的擴增曲線和溶解曲線。用iQ5 Real-time PCR儀的軟件得出各個樣本的CT值，按照2－ΔΔCT法計算各組基因表達與假手術(shù)組的比值。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，只有單一的擴增條帶，未見引物二聚體等非特異性條帶，說明擴增反應(yīng)是特異的。

表1 各目的基因的引物序列Tab 1 Specific primers for rabbit target genes

2 結(jié)果

2.1 心力衰竭模型的建立 心衰組和比索洛爾干預(yù)組兔術(shù)后出現(xiàn)精神狀態(tài)差，進食量減少，呼吸費力、口鼻發(fā)紺等。假手術(shù)組兔精神狀態(tài)及進食量較好。實驗過程中，假手術(shù)組死亡1只，心衰組死亡3只，比索洛爾干預(yù)組死亡3只。術(shù)后死亡原因主要為急性心力衰竭、腹腔感染，尸檢發(fā)現(xiàn)雙肺充血呈粉紅色、腸粘連、腹腔積液。8周處死時見心衰組大部分大白兔出現(xiàn)胸腔積液和腹水。三組在8周時心動超聲、血清BNP、心體比參數(shù)證實心力衰竭模型的建立(見表2)。與假手術(shù)組對比，心衰組兔心動超聲結(jié)果顯示 LAD、LVDD、LVDS、FS明顯升高(P＜0.01)、EF和 E/A 比值明顯降低(P＜0.01)，血清BNP水平明升高了近2倍(P＜0.01)，心體比明顯增大(P＜0.01)。比索洛爾干預(yù)6周，兔的 LAD、LVDD、LVDS、FS 比心衰組降低(P＜0.05)，EF、FS和E/A比心衰組明顯提高(P＜0.05)，BNP水平和心體比比心衰組顯著降低(P＜0.01)。這說明比索洛爾干預(yù)后可以明顯改善心衰兔的心功能，使左房、左室縮小。

表2各組兔心功能指標比較(±s)Tab 2Characteristics of heart function measurement in three groups(±s)

表2各組兔心功能指標比較(±s)Tab 2Characteristics of heart function measurement in three groups(±s)

與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與心衰組比較，#P ＜0.05，##P＜0.01

指標 假手術(shù)組 心衰組 比索洛爾干預(yù)組LAD/mm 7.73 ±0.41 9.16 ±1.77* 8.51 ±0.41*#LVDD/mm 11.68 ±1.09 19.67 ±3.98* 15.10 ±1.21*#LVDS/mm 7.39 ±1.89 13.33 ±3.64* 10.77 ±1.32*#EF/% 71.11 ±1.73 60.32 ±0.39* 67.62 ±0.25*#FS/mm 38.12 ±2.33 32.83 ±4.53* 34.29 ±4.57*#E/A 2.76 ±0.35 2.01 ±0.53* 2.35 ±0.81*#BNP/(nmol/L) 2.83 ±0.35 4.65 ±0.47* 3.78 ±0.67*##心體比/(g/kg) 2.42 ±0.31 4.02 ±0.54 3.18 ±0.61*##

2.2 三組兔左心房肌細胞的Ito通道m(xù)RNA的表達Kv4.3 編碼Ito，f通道 α 亞基，Kv1.4 編碼Ito，s通道α亞基。以假手術(shù)組兔的Kv4.3和Kv1.4 mRNA表達為1，心衰組的 Kv4.3和 Kv1.4 mRNA分別為0.41 ±0.03 和 0.71 ±0.05(vsSO，P＜0.01);比索洛爾干預(yù)組的Kv4.3和Kv1.4 mRNA相對表達量分別為 0.62 ±0.02 和 0.85 ±0.03(vsSO，P＜0.01)。結(jié)果顯示，心力衰竭時 Kv4.3 和 Kv 1.4 mRNA分別下調(diào)60%和30%，Kv4.3的mRNA水平下降比Kv1.4明顯;比索洛爾干預(yù)后Kv4.3和Kv 1.4 mRNA表達上調(diào)了20%和15%，說明比索洛爾可以部分逆轉(zhuǎn)Kv4.3和Kv1.4 mRNA表達的下調(diào)。

圖1 Kv4.3和 Kv1.4 mRNA 的表達Fig 1 Relative expression of Kv4.3 and Kv1.4 mRNA in three groups

2.3 三組兔左心房肌細胞的IKs和IKr通道m(xù)RNA的表達 ERG和KvLQT1分別編碼IKr和IKs的的α亞基，minK編碼β亞基。以假手術(shù)組兔的mRNA表達量為1，心衰組和比索洛爾干預(yù)組ERG mRNA分別為 0.95 ±0.07 和 0.96 ±0.06(vsSO，P＞0.05)。心衰組和比索洛爾干預(yù)組KvLQT1的mRNA 水平為0.68±0.02(vsSO，P＜0.01)和 0.88 ±0.03(vsSO，P＜0.01;vsHF，P＜0.01)。心衰組和比索洛爾干預(yù)組minK mRNA的水平分別為0.71±0.04(vsSO，P＜0.01)和 0.85 ± 0.05(vsSO，P＜0.01;vsHF，P＜0.01)。結(jié)果顯示，心力衰竭時 Kv-LQT1和minK的mRNA下調(diào)了32%和29%，ERG沒有明顯變化;比索洛爾干預(yù)后可以使KvLQT1和minK mRNA表達上調(diào)20%和14%。

圖2 ERG、minK和KvLQT1基因mRNA水平Fig 2 Relative expression of ERG，minK and KvLQT1 mRNA in three groups

2.4 三組兔左心房肌細胞的IK1通道m(xù)RNA的表達Kir2.1編碼IK1通道的α亞基。以假手術(shù)組兔的mRNA表達為1，心衰組和比索洛爾干預(yù)組的Kir2.1 mRNA相對表達量分別為0.78±0.03(vsSO，P＜0.01)和 0.89 ± 0.06(vsSO，P＜ 0.01;vsHF，P＜0.01)。心力衰竭時心房肌細胞Kir2.1的mRNA表達降低了22%，比索洛爾整體干預(yù)后升高Kir2.1的mRNA表達增加了11%，逆轉(zhuǎn)了IK1通道表達的下調(diào)。

圖3 Kir2.1 mRNA的表達Fig 3 Relative expression of Kir2.1 mRNA in three groups

3 討論

本研究中，我們用容量負荷聯(lián)合壓力超負荷心力衰竭兔研究心房肌細胞Ito、IKs、IK1通道表達下調(diào)，比索洛爾干預(yù)6周可以部分逆轉(zhuǎn)Ito、IKs、IK1通道m(xù)RNA表達的下調(diào)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)容量負荷聯(lián)合壓力超負荷心力衰竭兔左房心肌Ito、IKs、IK1通道表達下降。這種因心力衰竭導(dǎo)致的離子通道重構(gòu)與房顫引起的離子通道重構(gòu)有所不同。心力衰竭是房顫發(fā)生的病因之一［6］。持續(xù)的房性心動過速引起動作電位時程(action potential duration，APD)縮短，減弱APD 頻率依賴性［7］。盡管心力衰竭也是引起房顫的病因之一，但心力衰竭時APD縮短，而且APD的頻率依賴性減弱沒有房性心動過速時顯著。房顫和心力衰竭時APD的不同改變，其原因在于心房肌離子通道不同的重構(gòu)導(dǎo)致的。多項研究表明房顫時心房肌離子通道發(fā)生重構(gòu)［1，2］，如Ito、IKs減弱，而IK1不變，但是在慢性心力衰竭兔的心房肌中Ito、IKs和IK1都是減弱的［8］。目前研究結(jié)果顯示Ito通道在心衰和房顫心房肌細胞的變化是一樣的，都為表達下調(diào)［9］。房性心動過速時APD縮短是導(dǎo)致房顫多發(fā)折返的原因，但是心力衰竭時APD并不縮短，而是延長。這說明心力衰竭引起房顫不是通過損害APD頻率依賴性，而是通過其他的原因。慢性心力衰竭時心肌纖維化、心肌缺氧及縫隙連接蛋白43表達下降引起心肌傳導(dǎo)異常及自律性下降。這些變化可能是慢性心力衰竭引發(fā)房顫的主要原因［10，11］。此外慢性心力衰竭時IK1的下降引起細胞向閾電位去極化，導(dǎo)致異常沖動如晚后除極(DADs)發(fā)生［1］。

本研究中心衰時心房肌細胞Ito與心室肌細胞中Ito的變化相比［12］，我們發(fā)現(xiàn)，心房肌細胞中Ito變化比心室肌中的明顯，這說明Ito通道在心房肌細胞復(fù)極中起著重要的作用。

本文研究表明，當CHF患者出現(xiàn)AF時，AF發(fā)生的機制與房性心動過速引起的離子通道重構(gòu)不一樣，其發(fā)生的原因更多是由于心衰導(dǎo)致的離子通道重構(gòu)。但是當CHF患者AF發(fā)生后，是否會因房性心動過速引起離子通道再次發(fā)生重構(gòu)，這需要進一步的研究。了解到CHF和房性心動過速引起的離子通道重構(gòu)的不同，有助于我們加深對AF時離子通道重構(gòu)機制的認識，從而對AF的藥物治療有一定的指導(dǎo)意義。

CIBISⅡ試驗(cardiac insufficiency bisoprolol study)表明比索洛爾可顯著地降低心衰患者病死率和猝死率［13］。這些數(shù)據(jù)充分表明，比索洛爾作為β1選擇性受體阻滯劑，它在心衰治療中抗心律失常的作用。以往的研究表明β受體阻滯劑有逆轉(zhuǎn)心衰時離子通道重構(gòu)的作用［14］。我們另一項研究結(jié)果顯示比索洛爾可以部分逆轉(zhuǎn)心衰時心室肌K+通道重構(gòu)［12］。在本研究中，比索洛爾可以部分逆轉(zhuǎn)心房肌Ito、IKs、IK1表達下調(diào)。這說明比索洛爾對離子通道重構(gòu)的影響可能是其抗心律失常的機制之一。左房直徑與房顫的發(fā)生密切相關(guān)，而我們的研究發(fā)現(xiàn)比索洛爾干預(yù)后，左房的直徑較心衰時也明顯縮小。這說明比索洛爾也能抑制心房結(jié)構(gòu)，這可能也有益于房顫的防治。

心肌細胞離子通道重構(gòu)受到離子通道磷酸化、神經(jīng)體液因子、細胞內(nèi)信號分子等的調(diào)節(jié)。心力衰竭時β腎上腺素信號通路也發(fā)生重構(gòu)［15，16］，與神經(jīng)體液因子的作用是心肌離子通道重構(gòu)發(fā)生的機制［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭時心房肌細胞K+通道表達下調(diào)可能是心力衰竭時AF發(fā)生的離子通道機制。因此在心衰治療選擇藥物不僅具有抑制心室重構(gòu)、改善心肌缺血等作用，也要兼顧到對離子通道的影響。心衰時心房肌離子通道重構(gòu)與房性心動過速時引起的離子通道重構(gòu)不一致，對兩種病因引起的AF給予不同的防治策略。

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