隱匿性HBV感染者血清中HBV S基因變異分析

張玲榮，馬 媛，郝彥琴，朱新宇 (山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院感染病科，太原 030001;通訊作者，E-mail:zxy6608056@163.com)

隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection，OBI)是HBV感染的特殊形式，是臨床和流行病學(xué)的一大難題，影響對HBV的診斷，導(dǎo)致臨床漏檢及獻(xiàn)血員篩檢錯(cuò)誤，可造成HBV傳播，并與肝硬化、肝癌相關(guān)。目前隱匿性HBV感染的機(jī)制尚不清楚。本文對不明原因的肝病患者血清標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增的HBV S基因進(jìn)行序列分析，旨在從基因變異角度分析HBV隱匿性感染的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例選擇及血清收集 76例均為2010－07～2011－03在山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院因不明原因肝病住院的患者，其中男性47例，女性29例，年齡32－69歲，平均年齡(48.22 ±16.33)歲;病程1－9年;其中慢性肝炎31例，肝硬化41例，肝癌4例。入選患者包括血清乙肝病毒表面標(biāo)志物(HBVM)均陰性和單個(gè)或者多個(gè)抗體陽性者。所有患者排除其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、藥物性肝病及代謝性肝病等。收集10例HBV DNA載量為106copy/ml乙肝患者為陽性對照。

清晨空腹采肘靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清，置于－20℃待檢。

1.2 主要試劑與儀器 TaqDNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物公司;ELISA試劑購自美國Abbott公司;病毒核酸提取試劑盒購自美國OMEGA公司;Tanon Gis-2010全自動圖像處理系統(tǒng)為天能科技(上海)有限公司產(chǎn)品，PTC-100型PCR擴(kuò)增儀為美國MJ公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 選擇HBV基因組中保守的S區(qū)。外側(cè)引物:上游引物 5'－CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC－3'，下游引物5'－ATACCCAAAGACAAAAGAAAA－3';內(nèi)側(cè)引物:上游引物 5'－GCGGGTTTTTCTTGTTGAC－3'，下游引物 5'－GGGACTCAAGATGTTGTACA－3';產(chǎn)物條帶為564 bp。

1.4 病毒核酸的提取與擴(kuò)增 患者及陽性對照血清均采用柱吸附法提取HBV DNA，應(yīng)用巢式PCR方法擴(kuò)增nt56－nt767 HBV S區(qū)DNA片段，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 基因測序 從血清HBV DNA陽性者中隨機(jī)抽取8例測序，測序范圍為HBV S基因序列nt56－nt767，包括aa決定簇(124－147aa，nt524－nt595)，測序工作由大連寶生物公司完成。

2 結(jié)果

不明原因肝病患者血清HBV DNA S區(qū)擴(kuò)增結(jié)果見圖1，目的條帶位于500 bp－700 bp之間。76例不明原因肝病患者中16例血清HBVDNA陽性，陽性率21%。

圖1 不明原因肝病患者血清HBV DNA S區(qū)巢式PCR反應(yīng)電泳結(jié)果圖

8例隱匿性HBV感染者S區(qū)“a”蛋白決定簇基因測序結(jié)果見圖2。8例隱匿性HBV感染者“a”決定簇內(nèi)推導(dǎo)蛋白序列結(jié)果見圖3。“a”決定簇外基因突變位點(diǎn)如圖4所示。由圖2－4可知，S基因的擴(kuò)增區(qū)為nt203－nt767，共564 bp，包括a決定簇(124－147殘基)的基因，第122，160位氨基酸分別為賴氨酸和精氨酸，為adr亞型。a決定簇內(nèi)基因序列比對發(fā)現(xiàn)，nt587出現(xiàn)G→A的突變，推導(dǎo)氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，即較為常見的G145R突變。a決定簇外基因序列比對發(fā)現(xiàn)，nt355、nt484堿基均由A→C，推導(dǎo)氨基酸無變化，nt512堿基由C→A，推導(dǎo)氨基酸由脯氨酸變異為蘇氨酸。

圖2 8例隱匿性HBV感染患者S區(qū)“a”蛋白決定簇基因測序結(jié)果

圖3 8例隱匿性HBV感染者“a”決定簇內(nèi)推導(dǎo)蛋白序列結(jié)果

圖4 “a”決定簇外基因突變位點(diǎn)

3 討論

目前在臨床上約10%－20%的慢性肝病患者依據(jù)臨床表現(xiàn)和常規(guī)生化及血清學(xué)檢查仍不能明確病因，其中包括20%肝癌，15%肝硬化［1］。在部分血清HBsAg陰性的個(gè)體，應(yīng)用PCR技術(shù)可以檢測出血清和肝組織中HBV DNA陽性，稱之為隱匿性HBV感染。這種感染可發(fā)生于抗HBs和/或抗HBc陽性的患者，也可見于血清 HBVM均陰性的個(gè)體［2］。隱匿性HBV感染的機(jī)制尚不完全清楚，目前研究認(rèn)為，HBV低水平復(fù)制、抗原表達(dá)量低、HBV基因變異、HBV整合到宿主染色體中、外周血單核細(xì)胞系感染、宿主免疫應(yīng)答異常等均可導(dǎo)致隱匿性HBV感染［3，4］。目前關(guān)注較多的是病毒基因變異，因病毒基因變異可導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性，亦可導(dǎo)致病毒低水平復(fù)制，抗原表達(dá)量低，低于檢測限或?qū)е虏《绢w粒分泌障礙［5］。Nakamoto等［6］對 2 例確診為非乙非丙型肝炎患者中檢測出低水平的HBV，在隨訪中，用PCR方法擴(kuò)增出S或X基因，通過測序，發(fā)現(xiàn)HBV存在變異，其中1例DR2的5'端發(fā)生T→C的突變，另1例還同時(shí)存在X區(qū)的155 bp缺失。這些病毒分子發(fā)生的變異可從不同角度解釋發(fā)生隱匿性HBV感染的原因。

本實(shí)驗(yàn)對8例隱匿性HBV感染者，通過擴(kuò)增nt56－nt767 HBV S區(qū)DNA片段并基因測序，分析可能影響隱匿性HBV感染的分子生物學(xué)機(jī)制。由于隱匿性HBV感染病毒極低水平復(fù)制，病毒載量較低，故采用靈敏度較高的巢式PCR方法。在引物選擇上，選擇較為保守的S區(qū)。S區(qū)的變異影響了HBsAg的檢出和病毒大顆粒的裝載及釋放，也會導(dǎo)致病毒的低水平復(fù)制。所以，本次測序選擇S區(qū)，查找變異位點(diǎn)，分析與隱匿性HBV感染的關(guān)系。

HBsAg共有9個(gè)亞型，擁有一個(gè)共同保守的a決定簇，其主要由S區(qū)的124－147aa(氨基酸)構(gòu)成。在空間結(jié)構(gòu)上，由aa124與aa137和aa139與aa147的半胱氨酸經(jīng)雙硫鍵連接成兩個(gè)袢狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)對a決定簇的功能起重要作用。一般認(rèn)為a決定簇的145位氨基酸突變率發(fā)生最高，其次為126、141、122或者123也常發(fā)生突變。本組76例不明原因肝病患者中有16例為血清HBV DNA陽性者，陽性率21%。隨機(jī)選擇8例測序，a決定簇內(nèi)nt587出現(xiàn)G→A的突變，推導(dǎo)氨基酸由甘氨酸變異為精氨酸，即較為常見的G145R突變。a決定簇外基因序列比對發(fā)現(xiàn)，nt355、nt484堿基均由A→C，推導(dǎo)氨基酸無變化，nt512堿基由C→A，推導(dǎo)氨基酸由脯氨酸變異為蘇氨酸。

綜上所述，HBV感染人體是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，尤其是HBVM全陰性的隱匿性感染，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及HBV的變異、整合、隱蔽及宿主的免疫缺陷等。本研究發(fā)現(xiàn)，G145R突變在隱匿性HBV感染中發(fā)生，可導(dǎo)致S基因區(qū)變異，這可能是導(dǎo)致HBV隱匿性感染的重要原因之一，有待深入研究。

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