生殖細胞膜脂筏中精原糖脂質的分離純化及初步鑒定

張彥龍

（東北林業(yè)大學野生動物資源學院動物醫(yī)學系，哈爾濱 1 5 0 0 4 0）

在哺乳動物中生物體內，存在二種主要的硫酸化糖脂質，一種是大腦的神經鞘（sphingolipid）的硫酸鹽半乳糖神經酰胺（sulfated galactosylceramide）也稱之為硫酸糖脂質（galactosylsulfatide，SM4s；Sulfatide），在髓鞘（myelin sheath）中有較高的含量；另一種是存在于雄性生殖細胞的硫酸鹽半乳糖烷基甘油酯（sulfated galactosylalkylacylglycerol），稱之為是精原糖脂質（seminolipid，SM4g），精原糖脂質較高的表達在從精母細胞到精子細胞的各個階段的生殖細胞。它們基本結構硫酸根是由前體PAPA（3′-phosphoadennosine 5′-phosphosufate），通過它們共同的轉移酶—腦苷脂硫酸轉移酶（cerebroside sulfotransferase，CST）催化下，在高爾基膜上將PAPA上的硫酸根轉移到乳糖環(huán)的三位上，形成硫酸化的糖脂質［1，2］。

CST已成功的從人的腎癌細胞中精制，并且cDNA被克隆，CST基因突變鼠出現部分神經紊亂，生殖細胞在減數分裂前期停止分化而凋亡，導致雄性的不孕。Northern雜交證明在小鼠的腎臟、腦、睪丸、胃、小腸、肝臟、肺中發(fā)現了它的mRNA，通過精原干細胞移植技術，證明了在附睪中也有硫酸化糖脂質的存在，但結構和功能還有待解析［3~6］。在生殖細胞中糖脂質存在于生殖細胞的表面，精子細胞的精原糖脂質直接粘附在卵子的透明帶上，由此可能與受精有關，但具體功能還不甚了解，在生殖細胞中詳細的功能還有待探討［3~7］。為進一步研究硫酸化糖脂質的生物學特性和功能，純化硫酸化的糖脂質是開展此項研究前提條件之一。

脂筏（lipid-raft）又稱膜的微小功能區(qū)（microdomain），這些微小功能區(qū)富集有鞘糖脂和膽固醇中，包括甘油磷酸肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI），它們共同和所黏附的蛋白作為細胞膜的旁系結構組成部分的漂浮在細胞膜上的復合物，目前多項研究表明，具有蛋白的極性排列和細胞信號傳導的功能［8~10］。作為硫酸化的精原糖脂質在生殖細胞中是否以脂筏形式存在，是本研究目標。

為此，我們從牛的睪丸中提取精原糖脂質，從小鼠的睪丸生殖細胞中提純脂筏，通過檢驗證明精原糖脂質以脂筏形式存在于小鼠睪丸的生殖細胞膜中，這個結果對于今后進一步研究精原糖脂質及其相結合蛋白質的生物學特性必將起到一定的推動作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛的睪丸；氯仿；甲醇；蔗糖；orcinol；DEAESephadex A-25，Pharmacia Fine Chemicals（Piscataway，NJ）；C57BL/6 小鼠；silica gel HP-K 板（10cm ×10 cm，250 μm ），Whatman Inc.（Clifton，NJ）；Silica Gel 60 HPTLC plates（Merck）；超速離心機（Beckman），轉子（SW40Ti）。

1.2 精原糖脂質的提純

睪丸組織的處理：將牛的睪丸去除外膜，用刀切碎，稱取500 g，按10倍體積加入氯仿/甲醇=1/2混合液，在超生波中破碎組織并過夜攪拌，次日應用二層濾紙過濾除去雜質。

第一次DEAE-Sephadex A-25層析：離子交換柱先用甲醇洗滌一下，然后填充在甲醇中事先膨脹好的 DEAE-Sephadex A-25，總體積大約 110 cm3，應用氯仿/甲醇/水=30/60/8平衡 DEAE-Sephadex A-25，總體積為1 L；加入經濾紙過濾的牛睪丸樣本，應用平衡液洗滌，體積為柱床體積的10倍以上。加入0.1 mil/L醋酸銨/甲醇，收集洗脫液，每個管50 ml。每個管取100 μl滴加到硅膠板上，應用orcinol硫酸染色液染色鑒定，將含有硫酸糖脂質的管收集到一起，得到粗提精原糖脂質。將樣本粗體精原糖脂質在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮剩20 ml左右，加入200 ml去離子水，超聲波中分散粗提物，將樣本放入透析袋中除鹽，在4℃下透析，并換3~4次去離子水；將經過透析的樣本加入乙醇，在旋轉蒸發(fā)濃縮直至干燥，得到粗提的精原糖脂質命名為Pre。

硅膠層析：硅膠懸浮在100%氯仿中，添加柱床上，并應用氯仿平衡層析柱硅膠.濃縮的樣品溶解在氯仿中，經超聲波10 min處理，然后低速離心，將上層液加入平衡好的硅膠柱中.應用氯仿1 L洗滌，然后應用500 ml的氯仿/甲醇=9/1混合液，除去非特異性的物質。洗脫精原糖脂質，應用1 500 ml的氯仿/甲醇=4/1洗脫，每管50 ml收集，每個管取100 μl，TLC檢驗，TLC展開液為氯仿/甲醇=4/1。將含有精原糖脂質的管收集，按上述方法濃縮直至干燥，之后溶解到氯仿/甲醇/水=30/60/8中。

第二次DEAE-Sephadex A-25層析：用氯仿/甲醇/水=30/60/8平衡 DEAE-Sephadex A-25的柱床中，加入溶解到氯仿/甲醇/水=30/60/8的樣本，用平衡液按10倍柱床體積洗滌，再用5倍的甲醇洗滌。精原糖脂質洗脫，洗脫液為醋酸銨/甲醇，洗脫方法梯度洗脫 20 mil/L；40 mil/L；60 mil/L；80 mil/L；100 mil/L，每個管50 ml；每個管取100 μl除鹽后，TLC檢驗，展開液為氯仿/甲醇=4/1，將含有精原糖脂質的管收集，按上述方法濃縮直至干燥。

逆向層析除鹽：Sep-pak-C18和注射器連接，將濃縮的樣本溶解在水/甲醇=1/1，經超聲溶解制成懸液.Sep-pak-C18平衡液分別為氯仿/甲醇=2/1，用量7 ml；甲醇 7 ml；水 30~50 ml.將樣本加入柱床中；用大于10 ml的水洗滌.洗脫液分別應用甲醇3 ml；氯仿/甲醇=2/1用量6 ml，將洗脫液收集到一起，應用氮氣吹干樣本，經TLC檢驗樣本純度。

1.3 生殖細胞的制備

小鼠生殖細胞的制備100個生后60 d的小鼠睪丸無菌采集，按著精原干細胞的制備方法［2］，剝離睪丸去除睪丸被膜，取精細管PBS沖洗3次，置于32℃水浴搖床中，在0.25%/PBS胰蛋白酶消化20~30 min；DMEM沖洗，加入1 mg/ml膠原酶和200~500 μg/ml DNA酶作用20~30 min；吸管吹打使細胞分散，過55~77 μm尼龍篩濾過細胞，低速離心收集細胞，并用DMEM沖洗重懸，調整細胞濃度為105~106/ml，將細胞放于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM加10%FBS，培養(yǎng)條件為32℃。由于體細胞易貼壁生長，約6~7 h后晃動培養(yǎng)瓶收集半懸浮細胞，即可獲得高濃度生殖細胞，離心回收細胞，用PBS洗滌3次備用。

1.4 生殖細胞脂筏的制備

制備方法按著脂筏不溶于去垢劑的原理和方法［13］，在離心回收的生殖細胞中加入水解緩沖液（25 mMTris-HCI；PH7.5/0.15M NaCl，包 括 1%TritonX-100，1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride，1 mmol/L Na3Vo4，10 Trypsin inhibitor units/ml aprotinin5），在冰上應用Teflon勻漿器反復勻漿細胞上下40~50次，然后將勻漿好的細胞加入蔗糖，調節(jié)蔗糖最終濃度40%，加入Beckman SW40Ti轉子的離心管中，每個離心管4 ml，之后加入30%、5%的蔗糖兩個梯度，每個梯度在4 ml，在4℃下39 000 r/min離心18 h。30%、5%蔗糖溶解液為細胞水解緩沖液。

1.5 脂筏的回收

將在離心管中不溶性的條帶分別回收放入1.5 ml的小管中，15 000 r/min離心15 min，再用PBS洗滌3次，最后沉淀物溶解到氯仿/甲醇/水=10/20/1，經震蕩后在15 000 r/min下離心15 min，沉淀用于SDS-PAGE蛋白電泳鑒定，上清液在真空離心機蒸干后，經Sep-pak-C18除鹽，濃縮后應用TLC鑒定。

2 結果

2.1 牛睪丸中精原糖脂質提純及鑒定

我們利用DEAE-Sephadex A-25和硅膠交替層析，從牛的睪丸提純出高純度的精原糖脂質。在第一次應用DEAE-Sephadex A-25提純，我們獲得了粗提的精原糖脂質，在經硅膠層析厚，我們收集層析樣本，每個管 50 ml，每個管中提取 100 μl，經濃縮后，在硅膠板上薄層層析展開，如圖1A中所示Pre代表第一次經DEAE-Sephadex A-25粗提樣本，13-20表示是經硅膠顆粒層析后，每個樣本收集50 ml洗脫液，取100 μl經TLC展開后，在orcinol硫酸染色的結果，從第13-20管有精原糖脂質。在經第2次DEAE-Sephadex A-25離子交換層析，按著不同濃度的硫酸銨洗滌，我們發(fā)現，在60 mmol/L醋酸銨/甲醇洗脫下，在4~8管有精原糖脂質的存在，并且經Sep-pak-C18逆向層析除鹽后，我們點樣 5、10 μl后鑒定提純精原糖脂質的純度，表明獲得較高純度的精原糖脂質，如圖3C所示。

2.2 脂筏的提純及鑒定

按著制備精原干細胞的方法，制備生殖細胞懸液，這里包括精子形成過程中的各個階段的生殖細胞，在裂解液存在的下，應用勻漿機裂解生殖細胞，將其加入蔗糖梯度的最底層，蔗糖最終濃度在40%，經18 h超速離心后，我們可以看到兩條白色的帶，如圖2A所示，上層帶在5%和30%之間；下層帶在30%和40之間.回收兩條帶后，用有機溶劑分離脂筏，脂類部分經濃縮除鹽后薄層層析鑒定，并和從牛睪丸中提純的精原糖脂質比較，如圖2B所示，得到和提純精原糖脂質分子量大小相等的兩條帶，上面的帶含有較多的精原糖脂質，下面的含量比較少。同時被分離的蛋白在12%濃度的SDS-PAGE電泳，經銀染色證明有蛋白存在，由此說明，精原糖脂質和某種蛋白相結合，以脂筏的形式存在于睪丸的生殖細胞中。

圖1 D E A E-S e p h a d e x A-2 5和硅膠層析提純牛睪丸中的精原糖脂質，經薄層層析（T L C）o r c i n o l硫酸染色的結果F i g.1 P u r i f i c a t i o n o f b o v i n e t e s t i c u l a r s e mi n o l i p i d

圖2 從雄性生殖細胞中經蔗糖梯度離心提純的脂筏及其鑒定結果F i g.2 P u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f s e mi n o l i p i di nt h el i p i dr a f t o f t h e s p e r ma t o g e n i c c e l l me mb r a n e s

3 討論

關于從牛睪丸中提純精原糖脂質，我們參考Juan G的方法并略作改進［11］，應用DEAE-Sephadex A-25離子交換和硅膠顆粒層析相結合，并且應用逆向層析除鹽，經薄層層析（TLC）鑒定，獲得高純的精原糖脂質.在提純過程中也發(fā)現，按著文獻［11］所報道，在第一次離子交換后，粗提的精原糖脂質在加10%甲醇的氯仿中溶解后，硅膠不能很好的吸附住精原糖脂質，（數據沒有展示），所以應用純氯仿溶解精原糖脂質，得到較好的吸附效果；在第二次離子交換層析過程中，我們逐級增加醋酸銨的濃度，每個濃度洗脫液在300 ml，最終在60 mmol/L，洗脫出高純的精原糖脂質.經TLC檢驗及單克隆抗體染色（結果沒有展示）驗證提純的為精原糖脂質。

精原糖脂質在哺乳動物的生殖細胞中占總糖脂的90%以上，缺少精原糖脂質導致雄性的不孕［3］；在受精中過程中，在精子細胞膜上以脂筏形式起著粘結作用［12，13］。但是還有許多不明之處，如在生殖細胞分化過程中功能及細胞信號如何傳導，形成微小功能區(qū)所黏附蛋白分子有哪些，所以我們利用脂筏在去污劑不溶的特性，經蔗糖梯度離心，提純出脂筏，從蔗糖梯度離心結果可知，發(fā)現有兩條帶在不同濃度的蔗糖中，上層條帶的蛋白要多于下面的條帶，可以預測精原糖脂質在生殖細胞分化的不同時期有著不同的作用和功能，并黏附不同的蛋白分子.我們期待這些發(fā)現能夠解明精原糖脂質所連接蛋白質的生物學功能。

事先的研究已經知道精原糖脂質本質上為生殖細胞所必需［2］。脂筏與膜的信號轉導、蛋白質分選均有密切的關系［8］。我們這次從生殖細胞中提存了脂筏，并證明了精原糖脂質包括在脂筏中，由此推測精原糖脂質在生殖細胞細胞膜內，作為一個為受體信號傳導和運輸的功能性平臺，并且作為脂筏的組成部分而發(fā)揮關鍵作用.下面的工作就是必須解明精原糖脂質及其所結合的蛋白分子在生殖細胞膜上的分子生物學機制，這部分工作也已經開展，應用提純的脂筏制備出單克隆抗體，希望通過此研究方法能夠鑒定出硫酸化糖脂質所黏附的蛋白分子。

精原糖脂質在哺乳動物中除上述的生殖細胞一些生物學特性外，最近的研究表明，抗硫酸糖脂質的單克隆抗體能封閉IAV［influenza A/WSN/33（H1N1）virus］和硫酸糖脂質的結合，結果導致在核內病毒的核蛋白蓄積而影響到IAV病毒的復制，保護小鼠對流感病毒的致死性［13］。由于無論是硫酸糖脂質還是精原糖脂質有共同的抗原結構，所以提純精原糖脂質，將來可用于制備單克隆抗體之用，雖然糖脂質缺少免疫原性，這個問題最近已經通過制備突變鼠得到解決，應用提純的精原糖脂質免疫CST突變鼠，較容易的獲得單克隆抗體，并通過實驗研究得到證實［1］。

總之，硫酸化的糖脂質在生物體內的功能還有許多不明之處，通過對其脂筏的研究可進一步幫助我們解決硫酸化糖脂質的一些生物學功能，也對于研究其他脂質所形成脂筏的生物學功能研究起到推動作用。

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