原子力顯微鏡在食品組分研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張麗芬，劉東紅，葉興乾

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310229）

原子力顯微鏡在食品組分研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張麗芬，劉東紅*，葉興乾

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310229）

原子力顯微鏡因其分辨率高，樣品預(yù)處理簡單且可在空氣和水溶液環(huán)境中連續(xù)成像等諸多優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)研究領(lǐng)域。本文就原子力顯微鏡在食品主要組分中的研究進(jìn)行了綜述，旨在為原子力顯微鏡在食品科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供參考。

原子力顯微鏡，食品，組分，應(yīng)用

原子力顯微鏡（AFM）是20世紀(jì)80年代中期由Binning等人在掃描隧道顯微鏡（STM）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種具有原子級(jí)高分辨率的新型顯微工具，其利用細(xì)微的探針感知針尖端和樣品表面原子之間的相互作用力，通過原子力的變化反映樣品表面的起伏變化［1］。原子力顯微鏡與普通顯微鏡相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：高分辨率，能夠觀察從微米到納米范圍的微觀結(jié)構(gòu)，觀察范圍覆蓋了從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡所能觀察的領(lǐng)域，且有很高的垂直方向的分辨率（0.1nm）；原子力顯微鏡觀察時(shí)幾乎不用對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，使樣品保持在天然或接近天然狀態(tài)，可分析導(dǎo)體、半導(dǎo)體及絕緣體；樣品可在空氣和水溶液環(huán)境中連續(xù)成像，無需在真空條件下操作；由于原子力顯微鏡的針尖可以是不參與電化學(xué)反應(yīng)的非導(dǎo)體，所以它對(duì)反應(yīng)過程無擾動(dòng)，可以得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和信息。原子力顯微鏡因其上述優(yōu)勢(shì)目前已被廣泛應(yīng)用于材料科學(xué)、生物科學(xué)、化工、食品和醫(yī)藥研究等領(lǐng)域。本文綜述了原子力顯微鏡在食品主要組分中的應(yīng)用研究。

1 原子力顯微鏡工作原理、工作模式及特點(diǎn)

1.1 原子力顯微鏡工作原理

原子力顯微鏡由掃描探頭、電子控制系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)控制及軟件系統(tǒng)、步進(jìn)電機(jī)和自動(dòng)逼近控制電路四部分構(gòu)成。原子力顯微鏡與傳統(tǒng)的顯微鏡不同，其工作原理非常類似于盲人在讀盲文時(shí)，用手指來感受表面起伏，是對(duì)樣品表面的一種感知。

原子力顯微鏡使用一端固定而另一端裝有針尖的彈性微懸臂作為力傳感器。當(dāng)針尖在樣品上掃描時(shí)，針尖和樣品間的作用力會(huì)引起微懸臂的形變，后者導(dǎo)致反射激光束在檢測(cè)器中的位置發(fā)生改變，檢測(cè)器中不同象限間所接收到的激光強(qiáng)度差代表懸臂形變量的大小，在反饋電路的作用下，樣品表面起伏引起的微懸臂形變通過壓電管對(duì)Z方向的伸縮進(jìn)行補(bǔ)償，計(jì)算機(jī)采集每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的反饋輸出值，再轉(zhuǎn)化為灰度級(jí)，在顯示屏上表示出樣品的表面形貌［2］。原子力顯微鏡的基本工作原理如圖1所示。

1.2 原子力顯微鏡工作模式及特點(diǎn)

根據(jù)探針與樣品之間的力-距離關(guān)系可將原子力顯微鏡的工作模式分為三大類型：接觸模式（contact mode）、非接觸模式（non-contact mode）和輕敲模式（tapping mode）。

1.2.1 接觸模式 接觸模式又稱DC模式，在這種模式中，針尖與樣品始終相互接觸，掃描過程中，由于樣品表面的高低起伏使得針尖與樣品之間的作用力發(fā)生變化，從而使懸臂梁形變發(fā)生改變。這種方式由于針尖對(duì)樣品的直接作用力容易使樣品發(fā)生變形，導(dǎo)致成像效果不好。

圖1 原子力顯微鏡工作示意圖

1.2.2 非接觸模式 非接觸模式又稱AC模式，針尖在樣品表面的上方振動(dòng)，始終不與樣品表面接觸，懸臂以略高于其共振頻率的某一頻率振蕩，其振幅一般為幾納米（＜10nm），在這種模式中，由于針尖距樣品較遠(yuǎn)，與樣品表面的相互作用較小，因此對(duì)樣品造成破壞或發(fā)生移動(dòng)的可能性較小，適用于研究疏水性液體表面，但同時(shí)由于針尖距樣品較遠(yuǎn)的原因，導(dǎo)致以此模式工作的原子力顯微鏡圖象橫向分辨率降低，此種工作模式的掃描速率較低，工作效率不高。

1.2.3 輕敲模式 輕敲模式是一種介于接觸式與非接觸式之間的工作模式，克服了非接觸式掃描造成的顯微像分辨率較低的缺點(diǎn)，這種模式掃描時(shí)，懸臂梁上下振動(dòng)，使固定其上的針尖周期性地點(diǎn)觸樣品表面，有效降低了接觸模式中針尖與樣品表面的摩擦力，減小了對(duì)樣品表面的破壞程度，適合于較軟的食品和生物樣品，由于是半接觸式，其成像分辨率和工作效率都高于非接觸式。

2 原子力顯微鏡在食品組分研究中的應(yīng)用

食品中的蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)是食品的典型營養(yǎng)組分，具有獨(dú)特的化學(xué)與物理性質(zhì)以及營養(yǎng)功能，在食品生產(chǎn)加工過程中，這些組分的變化，會(huì)影響到食品體系色澤、風(fēng)味、營養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)和安全等，隨著人們對(duì)食品品質(zhì)要求的提高，目前，從組分的微觀結(jié)構(gòu)上探索其對(duì)食品品質(zhì)的影響越來越引起研究者的重視。

2.1 原子力顯微鏡在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

蛋白是食品中的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)之一，1993年，原子力顯微鏡作為一種先進(jìn)的工具首次應(yīng)用于食品中蛋白質(zhì)的檢測(cè)［3］。原子力顯微鏡可用以分析蛋白質(zhì)單體，Schneider等利用原子力顯微鏡研究了蛋白質(zhì)單體的分子量和蛋白質(zhì)體積之間的關(guān)系，蛋白質(zhì)分子量隨著蛋白質(zhì)體積的增加而增加，兩者之間具有很好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.994）；利用原子力顯微鏡所測(cè)蛋白質(zhì)體積可與所評(píng)估的蛋白質(zhì)體積進(jìn)行很好的比較，測(cè)量所達(dá)到的分辨率取決于蛋白質(zhì)與云母表面接觸的牢固程度［4］。原子力顯微鏡可對(duì)蛋白質(zhì)單體進(jìn)行三維成像并測(cè)量其分子體積，這種方法可以檢測(cè)多體蛋白中蛋白單體的數(shù)目，并可在分子水平上研究蛋白單體。Hallet等利用原子力顯微鏡首次在溶液狀態(tài)下研究了肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)，使原子力顯微鏡在溶液狀態(tài)下測(cè)量分子之間的相互作用成為可能［5］。Wang等利用原子力顯微鏡研究了類胡蘿卜素含量高低對(duì)玉米蛋白結(jié)構(gòu)的影響以及氯乙酸和油酸對(duì)玉米蛋白自組裝結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示：低類胡蘿卜素含量玉米蛋白有球形（直徑約為20nm）、棒狀（約為170nm）和分支形狀（約為200nm）；高類胡蘿卜素含量玉米蛋白只有球形（直徑約為20～200nm）；低類胡蘿卜素含量玉米蛋白添加氯乙酸和油酸后形成兩種類型的表面［6］。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)即形成凝膠，因此，蛋白質(zhì)聚集在凝膠過程中起著重要作用。原子力顯微鏡因分辨率高而成為研究蛋白質(zhì)聚集體的一種強(qiáng)有力的工具，可用于蛋白質(zhì)顆粒和聚集體的成像。Tay等利用原子力顯微鏡研究了大豆蛋白的聚集和凝膠過程，以更好地了解豆腐的質(zhì)地特性，原子力顯微鏡檢測(cè)了11S、7S和2S蛋白質(zhì)的聚合過程，結(jié)果顯示：聚集速率11S＞2S＞7S，2S蛋白雖然在大豆蛋白質(zhì)中含量最少，但是在聚集過程中起了關(guān)鍵作用。Tay等接著研究了大豆蛋白中2S片段結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，闡明了2S大豆蛋白和其他蛋白質(zhì)片段的功能和結(jié)構(gòu)特性［7-8］。原子力顯微鏡不僅可直接對(duì)單個(gè)分子和聚集體成像，也可用于生物聚集體之間相互作用的研究。Roesch等利用原子力顯微鏡研究了角叉膠和乳球蛋白體系所形成的多糖-蛋白凝膠，原子力顯微鏡結(jié)果顯示：天然蛋白質(zhì)的高度在2～6nm之間，蛋白質(zhì)會(huì)影響角叉膠的聚集；在固體接觸條件下研究混合物凝膠則可觀察到相分離；樣品的表面形貌研究顯示角叉膠和乳球蛋白之間缺少相互作用［9］。

近年來，研究者還利用原子力顯微鏡對(duì)蛋白膜的表面形貌及特性進(jìn)行研究。Shi等利用原子力顯微鏡研究了玉米蛋白膜的表面形貌，結(jié)果顯示：玉米蛋白膜澆注乙酸后要比澆注乙醇溶液后表面更加光滑［10］。Wang等利用原子力顯微鏡研究了玉米蛋白吸附于親水和疏水表面后玉米蛋白層的形貌，提出玉米蛋白膜的表面特性取決于其所吸附的表面，在親水性表面，其粗糙度值要高且具有明顯環(huán)形結(jié)構(gòu)，在疏水性表面，玉米蛋白膜表面沒有明顯特征［11］。

原子力顯微鏡除應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白凝膠等外，還可應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)和表面活性劑以及不同蛋白質(zhì)之間在界面處相互作用的研究。Gunning等利用原子力顯微鏡研究了表面活性劑的類型對(duì)空氣/水界面表面活性劑-蛋白質(zhì)交互作用的影響，破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的表面壓力的大小取決于表面活性劑的性質(zhì)，離子型表面活性劑所需的表面壓力要大于非離子型表面活性劑，離子型表面活性劑和蛋白質(zhì)之間的相互作用改變了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的力學(xué)特性［12］。Morris等利用原子力顯微鏡研究了空氣/水和油/水界面分子之間的交互作用［13］。原子力顯微鏡也可用于蛋白質(zhì)吸附于表面后對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，Touhami等利用原子力顯微鏡觀察了在不同pH條件下β-乳球蛋白吸附于云母表面后結(jié)構(gòu)和形貌的改變，結(jié)果表明：在不同pH條件下，原子力顯微鏡探針可以拉伸和展開吸附的β-乳球蛋白分子，在中性和酸性條件下，β-乳球蛋白分子維持了其固有的構(gòu)造，在堿性條件下，原子力顯微鏡探針和吸附蛋白層之間巨大的靜電排斥力與β-乳球蛋白分子的變形狀態(tài)相一致。原子力顯微鏡在探測(cè)單個(gè)分子在不同條件下結(jié)構(gòu)的改變上是一種強(qiáng)有力的工具［14］。

蛋白質(zhì)廣泛應(yīng)用于各種食品中，它不僅具有提高營養(yǎng)價(jià)值的功能，而且具有改善各種食品品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)的功效。原子力顯微鏡已應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，將其應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)性質(zhì)的分析是今后的一個(gè)研究方向。

2.2 原子力顯微鏡在多糖研究中的應(yīng)用

原子力顯微鏡在多糖方面的研究比較多。果膠是與食品特性密切相關(guān)的一種多糖，但由于果膠結(jié)構(gòu)的不均一性，很難研究其結(jié)構(gòu)，原子力顯微鏡因其高分辨率，則可直接觀察單個(gè)果膠分子和聚集體，并可表征果膠分子的不均一結(jié)構(gòu)。Yang等對(duì)氣調(diào)貯藏條件下黃桃中果膠微觀結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了一系列研究，系統(tǒng)地分析了果實(shí)中水溶性果膠、螯合性果膠和堿溶性果膠片段，并利用原子力顯微鏡得出了黃桃中這些果膠片段定性和定量方面的結(jié)構(gòu)特征，果膠作為細(xì)胞壁的主要成分，其分子結(jié)構(gòu)與果實(shí)的硬度等密切相關(guān)，氣調(diào)貯藏可以延長果實(shí)的貯藏期，并可抑制這些果膠的降解［15-16］。接著，Zhang等利用原子力顯微鏡研究了冷藏條件下兩種硬質(zhì)桃中堿溶性果膠微觀結(jié)構(gòu)與其質(zhì)地的關(guān)系，結(jié)果顯示：果實(shí)硬度與其堿溶性果膠含量和納米結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［17］。Zhang等還利用原子力顯微鏡研究了不同成熟度和品種對(duì)櫻桃果實(shí)細(xì)胞壁中堿溶性果膠結(jié)構(gòu)的影響，提出不同品種不同成熟度櫻桃果實(shí)細(xì)胞壁中堿溶性果膠含量與結(jié)構(gòu)的差異是導(dǎo)致其質(zhì)地特性差異的重要原因［18］。Fishman等利用原子力顯微鏡研究微波輔助萃取甜菜渣果膠的結(jié)構(gòu)并同時(shí)與柑桔果膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，原子力顯微鏡結(jié)果揭示甜菜渣果膠是線性單片段和球狀顆粒結(jié)合成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且其比柑桔果膠含有更多的球狀顆粒結(jié)構(gòu)［19］。

近年來，多數(shù)研究都集中在原子力顯微鏡對(duì)食品原料中多糖的測(cè)定上。淀粉是一種重要的食品成分并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。An等利用原子力顯微鏡研究了微波加熱對(duì)淀粉分子納米結(jié)構(gòu)的影響，通過對(duì)淀粉分子定性和定量分析，結(jié)果顯示微波加熱與對(duì)流加熱相比會(huì)引起淀粉的不完全凝膠；加熱模式對(duì)土豆淀粉的影響要比玉米淀粉大［20］。Sujka等利用原子力顯微鏡觀察了經(jīng)α-淀粉酶水解后土豆和玉米淀粉顆粒表面，結(jié)果顯示：天然的土豆和玉米淀粉顆粒是由直徑為20～40nm的顆粒組成的復(fù)雜表面，這些顆粒排列成較大的聚集物且在玉米淀粉中的排列更加規(guī)律；淀粉顆粒表面具有含凹陷和孔隙（玉米淀粉顆粒）的脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，α-淀粉酶水解導(dǎo)致碳水化合物鏈縮短和表面粗糙度增加，使得組成表面的顆粒更加明顯［21］。

原子力顯微鏡在多糖凝膠體系的研究上具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可直接觀察未染色的生物聚集體，提供成像物體在高度上的定量參數(shù)，且在輕敲模式下觀察時(shí)不會(huì)破壞軟樣品。Fishman等利用原子力顯微鏡研究了高甲氧基糖酸凝膠（HMSAG），得到了凝膠高度和相移的圖像，這些凝膠中的孔會(huì)隨著時(shí)間的作用而流動(dòng)且變平坦；他們首次提出水化天然凝膠中糖吸附于果膠上的結(jié)構(gòu)以及這些凝膠內(nèi)果膠的結(jié)構(gòu)框架［22］。Ptaszek等利用原子力顯微鏡研究了玉米淀粉親水性凝膠體系的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：在20℃時(shí)，瓜爾豆膠溶液和玉米淀粉凝膠體系呈同質(zhì)性，所有濃度下所觀察的凝膠體系的結(jié)構(gòu)一致；只在玉米淀粉-瓜爾豆膠混合物中觀察到了化合物之間的不相容現(xiàn)象，提高親水膠體的濃度將會(huì)使化合物之間的不相容性增加［23］。

食品親水膠體領(lǐng)域進(jìn)展的一個(gè)巨大推動(dòng)力是生物技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，這兩種技術(shù)的發(fā)展使微生物多糖成為了食品膠體領(lǐng)域的新成員，微生物多糖與傳統(tǒng)的材料像淀粉和果膠在特性上并不完全相同［24］。Ikeda等利用原子力顯微鏡研究了陽離子對(duì)微生物多糖-結(jié)冷膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示：添加四甲基鹽后，結(jié)冷膠具有分支的棒狀結(jié)構(gòu)；添加KCl、CsCl和CaCl2后會(huì)促進(jìn)螺旋間的聚集。Ikeda等同時(shí)研究了另一種微生物多糖-熱凝膠，熱凝膠在溶液中呈纖絲狀，當(dāng)加熱時(shí)則形成交聯(lián)的微凝膠體，對(duì)這些微凝膠體的成像表明：加熱誘導(dǎo)凝膠形成的初始階段微纖絲中單鏈部分解離，接著通過疏水相互作用形成交聯(lián)微纖絲［25-26］。

原子力顯微鏡還可用以操縱多糖分子，大多數(shù)食品大分子具有纏繞結(jié)構(gòu)，單個(gè)線性分子的聚合和纏繞將會(huì)導(dǎo)致對(duì)分子的潛在特性觀測(cè)不清晰，分子操縱可直接觀察食品大分子之間的反應(yīng)。操縱和展寬單個(gè)食品分子有益于大分子間的交互作用和鏈長的測(cè)定。Yang等利用分子梳和流體固定技術(shù)操縱并展寬了單個(gè)果膠分子，將果膠分子固定于云母片表面，利用原子力顯微鏡在空氣中測(cè)量，通過分子梳和流體固定技術(shù)排列和伸展。結(jié)果顯示：與流體固定技術(shù)相比，分子梳技術(shù)在分子操縱方面更加有效；通過分子梳效應(yīng)螯合性果膠可被伸展為向同一方向伸展的線性，堿溶性果膠顯示V形結(jié)構(gòu)，作者還指出不同的果膠具有不同的變化結(jié)果［27］。

2.3 原子力顯微鏡在脂質(zhì)研究中的應(yīng)用

原子力顯微鏡可直接在液體介質(zhì)中觀察碰撞顆粒，原子力顯微鏡探針和液滴之間的力曲線可以研究單個(gè)液滴的力學(xué)特性，從力曲線所得的表面張力和液滴大小的倒數(shù)可以判斷乳液的穩(wěn)定性。Wackerbarth等利用原子力顯微鏡記錄涂有酪蛋白和果膠的單個(gè)油滴的力曲線，通過力曲線和橫向膨脹反映油滴的形變，提出力體積成像可用于探測(cè)油滴的力學(xué)特性的橫向分布［28］。通過原子力顯微鏡力-距離測(cè)量可得到脂質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性之間的關(guān)系。

Patino等利用原子力顯微鏡研究了二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰膽堿在水-空氣界面處的結(jié)構(gòu)特性，布如斯特角顯微鏡（BAM）和原子力顯微鏡分別從微觀水平和納米水平上觀察了磷脂膜單分子層的結(jié)構(gòu)特征，兩者雖然原理不同，但是所得單分子層的結(jié)構(gòu)相似且相互補(bǔ)充，并驗(yàn)證了在空氣-水界面二棕櫚酰磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，原子力顯微鏡結(jié)果顯示了磷脂單分子層在納米水平上具有不均一性結(jié)構(gòu)，提出磷脂單分子層的結(jié)構(gòu)、形貌等對(duì)烴鏈和溶液的pH較敏感。原子力顯微鏡在檢測(cè)支持物、平坦基質(zhì)納米水平上的表面信息方面是一種強(qiáng)有力的工具，并可以直接提供結(jié)構(gòu)高度和形貌方面的信息［29］。

3 總結(jié)及展望

原子力顯微鏡作為一種強(qiáng)有力的納米研究工具已被應(yīng)用于食品領(lǐng)域。原子力顯微鏡可在納米水平上研究食品分子結(jié)構(gòu)和分子之間的交互作用；可定性和定量分析分子結(jié)構(gòu)、分子的交互作用以及操縱分子。利用原子力顯微鏡研究食品組分是當(dāng)前和今后的一個(gè)研究熱點(diǎn)。原子力顯微鏡應(yīng)用于食品組分研究具有自己的優(yōu)缺點(diǎn)和特殊應(yīng)用，如原子力顯微鏡針尖容易污染或損壞，成像結(jié)果會(huì)受針尖的形狀和尺寸等因素的影響，掃描面積小等，但隨著研究的不斷進(jìn)展，新的成像方式和制樣方法的不斷改進(jìn)，將使原子力顯微鏡技術(shù)日趨成熟。原子力顯微鏡作為一種先進(jìn)的技術(shù)，可與其它技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于食品品質(zhì)的研究。

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Application advance of atomic force microscope in food components researches

ZHANG Li-fen，LIU Dong-hong*，YE Xing-qian
（School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310229，China）

Atomic force microscope is widely used in the research of food science because of its high resolution from material that has undergone minimal preparation under air and aqueous solution environment.This paper reviewed some application of atomic force microscope in food components，which tried to provide references for the application and development of atomic force microscope in food science.

atomic force microscope；food；components；application

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0355-05

2009-12-14 *通訊聯(lián)系人

張麗芬（1982-），女，在讀博士研究生，研究方向：食品科學(xué)。