蛋白質(zhì)消化率測定方法的研究進(jìn)展

孫敏杰，木泰華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品化學(xué)與營養(yǎng)研究室，北京100193）

蛋白質(zhì)消化率測定方法的研究進(jìn)展

孫敏杰，木泰華*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品化學(xué)與營養(yǎng)研究室，北京100193）

對蛋白質(zhì)消化率進(jìn)行研究，不僅能使人們了解蛋白質(zhì)的消化特性，而且對于研究蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值具有重要的意義。為此，對國內(nèi)外食品中蛋白質(zhì)消化率測定的常用方法進(jìn)行了綜述與評價，并對各種蛋白質(zhì)消化率測定方法的優(yōu)缺點及適用的范圍進(jìn)行了討論。

蛋白質(zhì)，消化率，體內(nèi)，體外

評價食物營養(yǎng)價值的一個重要指標(biāo)就是蛋白質(zhì)的質(zhì)量。所謂“質(zhì)”是考察食物蛋白質(zhì)必需氨基酸的含量、模式以及機(jī)體對其消化、利用的程度，而“量”則是考察食物中蛋白質(zhì)含量的多少［1］。在以往對蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行研究時，主要以蛋白質(zhì)含量和必需氨基酸模式為主，常常忽略對其消化和吸收利用程度的研究。然而，某些蛋白質(zhì)，即便其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)，但由于受到蛋白質(zhì)來源（動物、植物）、非蛋白成分（膳食纖維、胰蛋白酶抑制劑）及生理等因素的影響，這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)消化、吸收和利用的程度可能會很低，從而導(dǎo)致營養(yǎng)價值偏低。蛋白質(zhì)消化率是指人體從蛋白質(zhì)中吸收的氮占攝入氮的比值，反映了食物蛋白質(zhì)被消化酶分解、吸收的程度［1］。目前測定食品蛋白質(zhì)消化率主要包括體外蛋白質(zhì)消化率和體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率兩種方法。因此，在對蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行評價時，應(yīng)該對其消化率進(jìn)行測定和分析，這對全面評價食物營養(yǎng)具有重要的意義。

1 蛋白質(zhì)消化率測定方法

1.1 體外蛋白質(zhì)消化率測定法

體外消化率測定法是模擬蛋白質(zhì)在人體內(nèi)消化過程的一種方法，該法不僅可以直接預(yù)測食物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，還可以提供各種蛋白質(zhì)在胃、腸內(nèi)消化和吸收的情況。這種方法不需要活體動物，而且與體內(nèi)消化率測定法有著很高的相關(guān)性，可以人為準(zhǔn)確地控制實驗條件，不同實驗室間測定的結(jié)果可比性好，測定效率和穩(wěn)定性高，成本低。體外蛋白質(zhì)消化率測定法主要包括兩個步驟，一是先利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)，然后再通過測定蛋白質(zhì)的水解度來計算蛋白質(zhì)的消化率或采用其它方法對蛋白質(zhì)的消化程度進(jìn)行評價。圖1為蛋白質(zhì)體外消化率測定法的一般步驟。

圖1 蛋白質(zhì)體外消化率測定法的一般步驟

1.1.1 蛋白質(zhì)的酶解過程 體外消化率測定法測定蛋白質(zhì)消化率的第一步就是使用蛋白酶水解蛋白質(zhì)來模擬食物在人體內(nèi)的消化過程，主要包括胃蛋白酶一步消化法、多酶一步消化法、人體活性胃液和十二指腸汁液一步消化法及胃蛋白酶和胰蛋白酶分步消化法等。胃蛋白酶一步消化法［2-5］采用胃蛋白酶直接進(jìn)行水解，用酶單一，操作簡單，但由于單一酶不能將某一蛋白質(zhì)水解成所有可利用的氨基酸，所以此方法測得的消化率偏低；多酶一步消化法多采用的是胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物直接進(jìn)行水解［6-11］，操作簡便，此混合酶具有協(xié)同作用，可將蛋白質(zhì)充分水解，測得的消化率較高［12］；人體活性胃液和十二指腸汁液一步消化法［13-14］是使用三腔管收集人體活性胃液和十二指腸汁液，可直接對所測蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，此方法可以很好地模擬人體對蛋白質(zhì)的消化，但是采用該法收集消化液的難度較大，胃液和十二指腸液中蛋白酶的種類和活力還會因受試者的年齡、胃腸消化功能等因素存在差異，導(dǎo)致實驗重現(xiàn)性差；胃蛋白酶和胰蛋白酶分步消化法在體外消化模型研究中應(yīng)用較廣，其原理是首先用胃蛋白酶在酸性條件模擬食物在胃內(nèi)的消化過程，用堿將胃蛋白酶活力鈍化后，再模擬營養(yǎng)成分在小腸的消化過程，用胰蛋白酶在中性條件下繼續(xù)消化，最后將已消化的營養(yǎng)成分與未消化的營養(yǎng)成分分開后并分別進(jìn)行測定［15-17］。該法能夠很好地模擬食物在消化道內(nèi)的消化過程，從而可以很好地反映食物蛋白在不同消化階段被消化的情況。此外，與人體胃液及腸液相比，胃蛋白酶及胰蛋白酶比較容易獲得，而且各種酶的組分也較易分析，測定的結(jié)果重現(xiàn)性好。

1.1.2 蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物分析及消化率計算的方法

1.1.2.1 pH降低法 pH降低法是通過測定一定消化時間后的pH降低值來測定蛋白質(zhì)消化率的方法。一般使用胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物對蛋白樣品進(jìn)行消化。其原理是在蛋白酶消化樣品的過程中，樣品蛋白肽鍵斷裂，釋放出氫離子，導(dǎo)致懸濁液的pH降低，在起始后第10min，該法與體內(nèi)大鼠糞氮平衡實驗所測消化率的結(jié)果具有較高相關(guān)性（r＞0.80）［6，18］。

pH降低法體外消化率的計算公式如下［7］：

式中：Y-體外消化率（%）；X-添加多酶溶液（胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物）的樣品消化第10min所測pH。

1.1.2.2 pH恒定法 pH恒定法是通過測定一定消化時間后pH降低所產(chǎn)生氫離子的濃度從而計算出蛋白質(zhì)消化率的方法。即在使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶混合液對蛋白質(zhì)進(jìn)行消化過程中，采用恒pH自動滴定儀，向消化液中不斷地滴入0.1mol/L NaOH溶液與蛋白質(zhì)水解過程中產(chǎn)生的氫離子作用，并使樣品消化液pH保持或恒定在8.0，再根據(jù)水解第10min時所添加的堿量來計算蛋白質(zhì)消化率［19］。此外，與pH降低法相比，pH恒定法與體內(nèi)消化法動物實驗的結(jié)果具有高度的相關(guān)性（r=0.96）。pH恒定法體外消化率的計算公式如下［12，17-18］：

式中：TD-蛋白質(zhì)消化率（%）；B10-水解第10min所添加NaOH溶液的量（mL）。

1.1.2.3 TCA沉淀法 即先使用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步對蛋白樣品進(jìn)行消化，然后向消化液中加入TCA溶液，離心將未消化的蛋白質(zhì)沉淀后測定其蛋白質(zhì)含量，最后計算蛋白質(zhì)消化率的方法。TCA沉淀法可精確定量未/已消化蛋白，但是結(jié)果要比pH恒定法低［12］。TCA沉淀法體外消化率的計算公式如下［12，21-25］：

現(xiàn)代人力資本理論的先驅(qū)西奧多·舒爾茨指出：“人的知識、能力、健康等人力資本的提高對經(jīng)濟(jì)增長的貢獻(xiàn)比物力、勞動力數(shù)量的增加要重要得多，在改變窮人的福利中，決定性的生產(chǎn)要素不是空間、能源和耕地，而是人的質(zhì)量的改進(jìn)。”

式中：N0-消化前蛋白質(zhì)樣品中TCA沉淀物中的氮含量（mg）；Nt-消化后的TCA沉淀物中的氮含量（mg）；Ntot-蛋白質(zhì)樣品中的總氮含量（mg）。

1.1.2.4 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法一般是對體內(nèi)外蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行定性分析的一種方法。該法可對不同消化時間及不同蛋白水解產(chǎn)物的分子量進(jìn)行推定，并可通過電泳條帶的變化直觀地分析和判斷蛋白消化難易的程度［14-15，26-27］。SDS-PAGE法可較為準(zhǔn)確地分析水解產(chǎn)物的分子量的變化，但操作較為復(fù)雜、時間較長。此外，在分析轉(zhuǎn)基因外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性實驗中，還可通過對蛋白質(zhì)在不同消化時間的水解產(chǎn)物進(jìn)行電泳和印跡，從而確定某一蛋白質(zhì)在模擬人體胃/腸消化過程中被完全消化的時間，推斷該外源蛋白在模擬人體胃/腸消化過程中的穩(wěn)定性［28］。

1.1.2.5 RP-HPLC法 RP-HPLC法是對體內(nèi)外蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析并能回收各種水解肽的一種方法。該法不僅可對不同消化時間及不同蛋白水解產(chǎn)物的組成及含量進(jìn)行分析，而且還能針對目標(biāo)肽進(jìn)行純化和收集［29］。但此法分析設(shè)備較貴，樣品需要進(jìn)行前處理。將水解后生成肽的總峰面積與水解后肽-蛋白質(zhì)的總峰面積相比，得出蛋白質(zhì)的消化率［30］：

1.2 體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測定法

體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測定法是通過動物體研究和分析蛋白質(zhì)的消化率、評價蛋白質(zhì)質(zhì)量的方法［1］。其中，采用大鼠糞氮平衡實驗是最適合預(yù)測人體消化率的一種較權(quán)威的方法［19］。其原理是待測蛋白質(zhì)（攝入氮）在被吸收前，首先在胃酸作用下，胃中的胃蛋白酶原轉(zhuǎn)換成胃蛋白酶對食物蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，接著是被腸中的胰蛋白酶和糜蛋白酶作用，最后，少量的來自微生物細(xì)胞和脫落的腸內(nèi)粘膜細(xì)胞的糞代謝氮及不能被消化的食物蛋白質(zhì)經(jīng)過結(jié)腸時，一起從糞便中排出（糞氮）［31］。如果不計糞代謝氮，攝入氮與糞氮的差值占攝入氮的比例稱為表觀消化率。由于表觀消化率的測定方法簡單易行，所以應(yīng)用較廣。但是表觀消化率所測得的結(jié)果與實際值相比較低。因此，需要對無蛋白飼料條件下所產(chǎn)生的糞代謝氮進(jìn)行測定來校正表觀消化率。然而，由于無蛋白飼料會引起動物機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以現(xiàn)多采用向飼料中添加5%具有高消化性酪蛋白后再測定糞代謝氮的方法［32］。這種含糞代謝氮的消化率計算方法被稱為蛋白質(zhì)的真消化率［33-34］。其計算公式如下：

蛋白質(zhì)真消化率（%）=氮吸收量/攝入氮=［攝入氮-（糞氮-糞代謝氮）］/攝入氮×100% 式（5）

大鼠糞氮平衡實驗的關(guān)鍵是對糞便的精確收集，通常使用傳統(tǒng)大鼠飼養(yǎng)籠不能嚴(yán)格分離動物的糞便及尿液［32］。因此，目前已有新型的大鼠代謝籠問世，可以很好地將大鼠糞便與尿液進(jìn)行分離。

2 討論

蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率測定法與體外消化率測定法各有利弊。1991年在意大利羅馬舉辦的FAO/WHO蛋白質(zhì)質(zhì)量評價專家咨詢會指出，蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率、體外消化率與人體臨床研究測定的方法得到的數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性［35］。體內(nèi)法測定的消化率能夠比較真實地反映動物對食物的消化情況，但體內(nèi)消化率測定法操作復(fù)雜、時間長、費(fèi)用高，且實驗動物對外界環(huán)境的要求較高，季節(jié)、溫度、光照等都會影響消化率的測定值。因此，體內(nèi)消化率測定法可以作為一種驗證的方法，但不適合做大規(guī)模食品評定。相比而言，體外消化法是利用精制的消化酶或生物體消化道酶提取液在試管內(nèi)進(jìn)行的消化實驗，其測定值可較為準(zhǔn)確地反映動物對食物的消化率［36］。該方法簡便且重復(fù)性好，不僅適用于大規(guī)模食品評定，更適用于蛋白質(zhì)營養(yǎng)質(zhì)量的分級和對蛋白質(zhì)體內(nèi)營養(yǎng)價值的預(yù)測，并能檢測出同種物料的不同樣品間質(zhì)量的微小差異。

然而，還存在影響體外消化率測定結(jié)果的各種因素，如被測食物的粒徑及組成成分、蛋白酶的數(shù)量及種類、消化條件、蛋白質(zhì)水解物的分析方法等。因此，用一個單純的體外消化模型來再現(xiàn)所有復(fù)雜的生化和生理過程是不可能的［6］。此外，體外和體內(nèi)消化率測定法結(jié)果間還存在一定的差異，所以在選用體外消化率測定法對具體食物蛋白消化率進(jìn)行測定和分析時，盡可能比較兩種方法間的相關(guān)性［37］。相關(guān)系數(shù)越高，表明體外消化率測定法可信度就越高。因此，為了更科學(xué)地模擬人體消化，體外消化率測定法還需要進(jìn)一步完善和發(fā)展。

3 結(jié)論

體外蛋白質(zhì)消化率測定法和體內(nèi)消化率測定法都是預(yù)測蛋白質(zhì)在人體中消化率較常用的方法。在體外蛋白質(zhì)消化率測定法中，pH降低法與pH恒定法操作簡便、快速、重現(xiàn)性好，特別是pH恒定法與體內(nèi)法所測結(jié)果相關(guān)性最高；TCA沉淀法可精確定量未/已消化蛋白含量，但測定值偏低；SDS-PAGE法與RP-HPLC法可對消化產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，但需前處理，且測定時間較長；在體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測定法中，蛋白質(zhì)的真消化率最為準(zhǔn)確。

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Development of methods for the determination of protein digestibility

SUN Min-jie，MU Tai-hua*
（Laboratory of Food Chemistry and Nutrition Science，Institute of Agro-Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

The study of protein digestibility，not only makes people aware of the characteristic of protein digestion，but also is of great significance to study the nutritional value of protein and its application.Therefore，commonly used methods for the determination of protein digestibility of foods at home and abroad were reviewed and evaluated.ln addition，the advantages and disadvantages，and the scope of application of different methods for the determination were also discussed.

protein；digestibility；in vivo；in vitro

TS201.2+1

A

1002-0306（2011）02-0382-04

2010-01-15 *通訊聯(lián)系人

孫敏杰（1982-），女，在讀博士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)。

國家“863”計劃資助項目（2006AA10Z332）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助。