反相高效液相色譜法測定食品中的多種黃色工業(yè)染料

楊 琳，陳青俊，丁獻榮，汪慶旗，徐雙陽

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州310009）

反相高效液相色譜法測定食品中的多種黃色工業(yè)染料

楊 琳，陳青俊，丁獻榮，汪慶旗，徐雙陽

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州310009）

食品中的非食用色素工業(yè)染料經(jīng)無水乙醇超聲振蕩數(shù)次提取，于45℃真空濃縮，高速離心，采用HPLC系統(tǒng)用20mmol/L醋酸銨溶液和甲醇梯度洗脫，在二極管陣列檢測器430nm和480nm下檢測，用外標法峰面積定量。結(jié)果顯示：五種工業(yè)染料在0～20.0μg/mL濃度范圍內(nèi)的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好；加標回收率為90.9%～98.9%。該方法簡便易行，準確可靠。

堿性橙嫩黃O，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，酸性間胺黃，高效液相色譜，二極管陣列檢測器

近年來，隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，食品安全問題越來越受到人們的重視，但是卻有一些不法商販為了一己私利，為了增加食品的色澤光亮，以次充好，在鮮海魚、豆制品、腐竹等食品中使用黃色的工業(yè)染料，這類工業(yè)染料大都屬于偶氮類染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色，已經(jīng)被認定是一種可以使人致癌的物質(zhì)，不得用于與人體長期直接接觸的紡織和服裝產(chǎn)品中，根據(jù)《中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標準》及《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》的相關(guān)規(guī)定，為禁止用作食品添加劑的化學制品。目前工業(yè)染料的品種繁多，就需要建立一個快速準確測定食品中多種工業(yè)染料的方法。本方法針對市場上曾經(jīng)出現(xiàn)過的五種常用的黃色工業(yè)染料：堿性嫩黃O，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，酸性間胺黃，從研究工業(yè)染料的提取、富集等前處理條件，運用高效液相色譜分離，利用DAD二極管陣列檢測器進行檢測，建立了一套適合實驗室快速準確測定食品中多種黃色工業(yè)染料的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 色譜純；標準品堿性橙嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性間胺黃 含量≥99%，sigma；標準儲備液 分別準確稱取0.1000g五種工業(yè)染料標準物質(zhì)，用50%甲醇水溶解并定容到100mL，配成濃度為1.00mg/mL的儲備液；測定前將儲備液稀釋50倍到20μg/mL，此為標準工作液；醋酸銨，無水乙醇。

高效液相色譜儀 125雙溶劑泵，168二極管陣列檢測器，508自動進樣器，32Karat數(shù)據(jù)工作站；超聲波振蕩器，高速離心機（16000r/min），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 稱取20g左右（準確至0.01g）均質(zhì)樣品，置于150mL燒杯中，加入2g無水硫酸鈉攪拌均勻，加入30mL無水乙醇超聲提取15min，將提取液用濾液過濾到圓底燒瓶里，再加入30mL無水乙醇，重復(fù)上述操作三次，合并提取液，于45℃真空濃縮至近干，氮氣吹干后用流動相洗脫并定容至5mL容量瓶中，樣液用高速離心機12000r/min離心10min，取上清液待測。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱（4.6× 150mm，5μm）；流動相：0.02mol/L醋酸銨緩沖液和甲醇按以下梯度洗脫：0～8min，甲醇 11%～65%；8～14min，甲醇65%～73%；16～18min，甲醇73%～100%；20～24min，甲醇100%～11%；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：430nm（堿性橙嫩黃O、堿性橙2、酸性間胺黃），480nm（堿性橙21、堿性橙22）。

1.2.3 吸收波長的選擇 分別取適量的標樣用50%的甲醇水溶液溶解，配制成濃度為10μg/mL的溶液，采用二極管陣列檢測器在190～600nm范圍內(nèi)進行在線光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長的選擇

各標準品的二極管陣列檢測器190～600nm范圍內(nèi)的光譜掃描圖如圖1～圖5所示。由圖可知，堿性橙2的λmax=439nm（圖1），堿性橙嫩黃O的λmax= 430nm（圖2），酸性間胺黃的λmax=430nm（圖3），堿性橙21的λmax=485nm（圖4），堿性橙22的λmax= 485nm（圖5）。為了可以同時測定多種黃色工業(yè)染料，達到最佳的靈敏度，本實驗綜合考慮選擇波長430nm和480nm為檢測波長。

圖1 堿性橙2的光譜掃描圖

圖2 堿性橙嫩黃O的光譜掃描圖

圖3 酸性間胺黃的光譜掃描圖

2.2 標樣圖譜

在1.2.2色譜條件下，標樣圖譜見圖6和圖7。按照色譜峰的保留時間定性，外標法峰面積定量。

2.3 樣品預(yù)處理條件的選擇

2.3.1 提取時間的選擇 為研究提取時間對樣品中工業(yè)染料測定值的影響，分別考察了10、15、20min的提取率。實驗結(jié)果表明，隨著提取時間的增加，樣品中工業(yè)染料的測定值有所升高，但提取時間為15min和20min重復(fù)提取三次，測定值幾乎無差別，因此選擇提取時間為15min。

2.3.2 濃縮方式的選擇 為了提高方法的檢出限，樣品要經(jīng)過濃縮，采取了水浴蒸干和低溫真空濃縮兩種方法，實驗結(jié)果見表1。

圖4 堿性橙21的光譜掃描圖

圖5 堿性橙22的光譜掃描圖

圖6 掃描范圍168～430nm

圖7 掃描范圍168～480nm

表1 不同濃縮方式回收率結(jié)果（%，n=3）

實驗發(fā)現(xiàn)，堿性橙2和堿性橙嫩黃O受溫度的影響很大，當采用水浴蒸干時，過高的溫度使堿性橙2和堿性橙嫩黃O回收率很低；堿性橙2和堿性橙嫩黃O在50℃以上容易分解，低溫真空濃縮可以得到比較高的回收率，但是過低的溫度需要花費很長的時間，濃縮的效果也欠佳，本實驗采用了45℃真空濃縮，可以達到比較滿意的效果。

表2 回歸方程、檢出限及回收率結(jié)果

2.4 線性關(guān)系、檢測限、精密度和回收率

五種工業(yè)染料的定量標準曲線、檢測限、精密度和回收率見表2。

2.5 干擾性實驗

在本研究方法的色譜條件下，食品中常見的添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、咖啡因在430、480nm幾乎無吸收，不會干擾堿性橙的測定；食品中常見的食用色素檸檬黃、日落黃的保留時間分別為4.2、7.3min（色譜圖見圖8），均不干擾堿性橙嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22，酸性間胺黃的測定。

3 結(jié)論

稱取20g左右的樣品，經(jīng)無水乙醇超聲振蕩數(shù)次提取，于45℃真空濃縮，高速離心，上清液進HPLC以20mmol/L醋酸銨溶液和甲醇梯度洗脫，在二極管陣列檢測器430nm和480nm下檢測，用外標法峰面積定量。五種工業(yè)橙染料在0～20.0μg/mL濃度范圍內(nèi)的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好；方法的最低檢測限堿性橙嫩黃 O為 0.1μg/mL，堿性橙 2為 0.1μg/mL，堿性橙 21為 0.1μg/mL，堿性橙 22為0.1μg/mL，酸性間胺黃為 0.1μg/mL（以進樣濃度計）；方法的回收率為90.9%～98.9%?？傊?，本方法用于食品多種工業(yè)染料的測定，具有準確、快速、簡便等優(yōu)點。

圖8 8種混合標準溶液色譜圖（Det 168～430nm）

［1］鐵曉威，黃百芬，任一平.RP-HPLC法測定染色黃魚中堿性橙含量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2004，14（1）：59-60.

［2］谷巖，崔松林，周宇，等.高效液相色譜法測定辣椒粉中堿性橙、玫瑰精含量［J］.分析測試技術(shù)與儀器，2006，12（4）：202-204.

［3］王佩珍，陳蕓，朱維芳，等.高效液相色譜法測定紡織品上禁用偶氮染料［J］.化學世界，2000（7）：353-355.

RP-HPLC determination of five kinds of yellow industrial dyes in foods

YANG Lin，CHEN Qing-jun，DING Xian-rong，WANG Qing-qi，XU Shuang-yang
（Zhejiang Gongzheng Testing Center Inc.，Hangzhou 310009，China）

A method for determination of inedible industrial colorants in foods by high performance liquid chromatography（HPLC）was established.Samples were extracted by anhydrous alcohol using ultrasonic.The extraction was concentrated in vacuum and 45℃，then analyzed by HPLC with 20mmol/L ammonium acetate and methanol，detection wavelength were 430nm and 480nm.The results showed thatindustrial dyes in the concentration of 0～20.0μg/mL had good linearity with peak area.The recovery rate with standard addition was 90.9%～98.0%.The method was simple，feasible and accurate.

auramine O；chrysoidine G；astrazon Orange G；astrazon Orange R；metanil yellow；HPLC；DAD

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0350-03

2010-02-01

楊琳（1979-），女，在讀碩士，工程師，研究方向：食品中微量元素測定和高效液相色譜的分析。