超高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測中藥散劑中磺胺類藥物

劉素梅，韓 立，方忠意，李華岑，王 麗，張躍京，臧合英

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008;2.鄭州大學藥學院，鄭州 450001)

隨著食品安全逐漸成為全球性的熱點話題，畜產品中獸藥殘留問題對動物性食品安全的影響逐漸凸顯出來。中藥在畜牧生產中作為藥物或飼料添加劑用于防治動物疾病、提高動物生產性能、改善產品品質越來越受到重視。但有些不法企業(yè)為了增強中藥的療效，常在中獸藥中非法添加化學藥物，造成畜禽機體中毒，產品中獸藥殘留超標等問題，嚴重危害人們的健康。

磺胺類藥物為化學合成抗菌藥，其中有些成分具有抗原蟲作用，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺對甲氧嘧啶等，雞球蟲散和驅蟲散為《中國獸藥典》中收載的抗原蟲的藥物，本試驗對這兩種散劑中添加上述磺胺類藥物進行了高效液相色譜法的研究［1］，利用二極管陣列檢測器進行樣品的全波長掃面，根據樣品的色譜保留時間、吸收光譜進行定性檢查，以色譜峰面積進行定量計算，可以快速準確地檢查出中藥中是否添加磺胺類藥物及其含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備 Waters UPLC超高效液相色譜，二極管陣列檢測器，Empower2色譜工作站;MILIPORE超純水器;METTLER XP205電子天平。

1.2 試藥及試劑 磺胺嘧啶對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為H0361103，含量為100.0%;磺胺二甲嘧啶鈉對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為 H0371008，含量為99.8%;磺胺間甲氧嘧啶鈉對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為C0031007，含量為99.4%;磺胺對甲氧嘧啶對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為H040105，含量為100%;磺胺氯吡嗪鈉對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為H0281207，含量為100.0%;磺胺喹噁啉對照品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為H121104，含量為99.0%;雞球蟲散由鄭州神普科技有限公司提供;驅蟲散由河南旭隆獸藥有限公司提供;甲醇和乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm)色譜柱;檢測波長范圍:190～400 nm，柱溫30℃，進樣量為3 μL;流動相 A相:0.017 mol/L的磷酸溶液，B相:乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標準工作液的制備 精密稱取六種磺胺類藥物各100 mg分別置50 mL量瓶中，加甲醇配成2 mg/mL的標準貯備液，臨用前用流動相稀釋成濃度為 0.2、0.5、1、5、20、50、100、200 μg/mL 的標準混合工作液，過0.2 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 樣品制備

2.3.1 參照《獸藥使用指南》里磺胺類藥物的用量及向有關獸藥企業(yè)技術人員了解，磺胺類的添加量在0.8% ～1%左右，所以本實驗按照磺胺類藥物含量為1%的量進行添加。取雞球蟲散和驅蟲散各10 g，精密稱定，分別精密加6種磺胺類藥物各0.1 g，充分混勻，制成陽性樣品(即磺胺類藥物含量為1%)。

2.3.2 取雞球蟲散和驅蟲散作為陰性樣品。

2.4 供試品溶液的制備 取樣品1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超聲提取30 min，靜置，精密量取上清液5 mL置50 mL量瓶中，加初始比例的流動相稀釋至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.5 線性關系的考察 取磺胺類系列標準工作液，濃度由低到高依次進高效液相色譜儀，記錄277 nm處色譜圖，以對照品濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程和相關系數見表2，色譜圖見圖1-圖5。

表2 回歸方程和相關系數

2.6 準確度和精密度考察 精密稱取2.3.1項下的陽性樣品1 g，按照2.4項下供試品溶液的制備進行操作，進高效液相色譜儀分析，測定6種磺胺類組份的峰面積，計算回收率及RSD，結果見表3。

圖5 雞球蟲散陽性樣品色譜圖

表3 回收率測定結果

2.7 檢測限的確定 分別取一個雞球蟲散和驅蟲散陽性樣品譜圖，計算每個組分的信噪比(S/N)，按S/N≥3為檢測限，確定雞球蟲散和驅蟲散中，檢測限為0.02%。

2.8 定量限 按照信噪比(S/N)=10為定量限，確定定量限為0.05%。取驅蟲散和雞球蟲散陰性對照1 g，加入陽性添加樣品(1%)0.05 g，各5份，按照供試品溶液的制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，計算回收率，結果見表4。

表4 定量限回收率試驗結果

2.9 專屬性 取驅蟲散、雞球蟲散陰性樣品各1 g，按照供試品溶液制備方法進行制備，進高效液相色譜儀分析，色譜圖見圖2、圖4。由圖可知，在該色譜條件下6種峰無干擾。

2.10 樣品檢測結果判定 供試品色譜圖中如出現與相應對照品峰保留時間一致的色譜峰，查看該峰的光譜圖，若與對照品光譜圖無明顯差異，最大吸收波長一致，則表示檢出該組分。然后采用277 nm處峰面積，根據外標法計算含量。

2.11 HPLC色譜條件 由于條件局限，本實驗采用的是超高效液相色譜-二極管陣列檢測器進行試驗研究。考慮到UPLC應用不如HPLC普遍，以270 nm為吸收波長，將色譜條件由UPLC的方法向HPLC進行了轉換，具體色譜條件為:Waters 2695高效液相色譜儀，2489紫外檢測器，Empower2色譜工作站;XBridge C18(5 μm，4.6 ×150 mm)色譜柱，梯度洗脫程序見表5，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。

表5 HPLC梯度洗脫程序

3 討論

3.1 實驗過程中先后嘗試了甲醇-乙腈-水-冰乙酸系統［2］、乙腈-三乙胺溶液系統和乙腈-磷酸溶液系統［3］，最終確定柱效高、分離度好的乙腈-0.017 mol/L磷酸溶液系統作為流動相。

3.2 中藥中基質復雜，干擾成分比較多，采用二極管陣列檢測器，通過光譜鑒別可以排除干擾，準確地檢測中藥中是否添加磺胺類藥物。

3.3 經過對6種磺胺類藥物的反復試驗，甲醇對這6種藥物有很好的溶解性，因此，樣品提取溶劑用甲醇。樣品經過超聲提取，提取效率高，同時考察了超聲30 min和超聲60 min的提取效果，結果兩者沒有顯著差異，因此本實驗選擇了超聲提取30 min的方法進行供試品溶液的制備。另外根據標準曲線線性范圍，本實驗選取了曲線中間點作為樣品上機濃度。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版二部［S］.

［2］高迎春，蘇 梅，魏秀麗，等.薄層色譜和液相色譜法鑒別中獸藥散劑中摻加的磺胺喹噁啉鈉［J］.中國獸藥雜志，2010，44(2):23-25.

［3］動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法-高效液相色譜法［S］.