萬米跑后外周血淋巴細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的動態(tài)變化

許國喜

(燕山大學(xué)體育學(xué)院，河北秦皇島 066004)

萬米跑后外周血淋巴細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的動態(tài)變化

許國喜

(燕山大學(xué)體育學(xué)院，河北秦皇島 066004)

目的:觀察萬米跑后不同時相人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡及血液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的變化，探討大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后血液淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法:選取8名參加運(yùn)動會萬米長跑的體育專業(yè)男運(yùn)動員，分別在運(yùn)動前1天(RG)、運(yùn)動后2h、24h和48h采血抗凝，分離淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測血液淋巴細(xì)胞凋亡率，并測定血清中SOD活性、GSH和MDA含量。結(jié)果:運(yùn)動后2h和24h外周血淋巴細(xì)胞凋亡率顯著高于安靜水平，2h顯著高于24h;48h基本恢復(fù)安靜水平。2h血漿中SOD酶活性、GSH和MDA含量均較安靜水平顯著升高;24h SOD和MDA仍顯著高于安靜水平，而GSH水平則無顯著差異;48h后SOD、GSH和MDA均較安靜水平無顯著差異。外周血MDA含量與淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r:0．757;P:0.001)。結(jié)論:萬米長跑對外周血淋巴細(xì)胞凋亡率有誘發(fā)效應(yīng)，而凋亡率隨時間的變化呈現(xiàn)“開窗理論”特征。運(yùn)動引起的機(jī)體自由基代謝失衡可能是淋巴細(xì)胞凋亡率變化的原因之一。

淋巴細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;外周血;萬米跑

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物維持其完整性和自身穩(wěn)定而在凋亡相關(guān)基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡方式，是機(jī)體維持其生理平衡的重要手段［1］。對免疫系統(tǒng)來說，機(jī)體淋巴細(xì)胞的凋亡率常常被作為判斷機(jī)體免疫能力的一項重要指標(biāo)［2］。研究認(rèn)為，大強(qiáng)度急性運(yùn)動時，由于應(yīng)激激素的急劇增高，血液動力學(xué)發(fā)生急劇變化，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞快速動員入血，而在大強(qiáng)度運(yùn)動后，淋巴細(xì)胞濃度降低，增值分化及活性降低，免疫球蛋白含量及功能也受到影響，出現(xiàn)免疫低下期，這一免疫低下期被 Pedersen稱為“open windows”期［3］。動物實驗表明，不良的外界刺激可以造成機(jī)體淋巴細(xì)胞凋亡率的改變，從而影響機(jī)體的免疫功能［4］。已有的研究認(rèn)為大強(qiáng)度耐力運(yùn)動和急性運(yùn)動均可引起機(jī)體氧化應(yīng)激，從而使自由基代謝失衡，危害機(jī)體。有學(xué)者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)過量運(yùn)動可誘發(fā)淋巴細(xì)胞凋亡，降低機(jī)體免疫能力，加速衰老［5］。但人體大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后外周血淋巴細(xì)胞凋亡的時相性特征研究較少。本文采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測體育專業(yè)學(xué)生萬米長跑運(yùn)動后不同時相外周血淋巴細(xì)胞的凋亡情況，探討大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后機(jī)體免疫能力低下的可能機(jī)制;同時通過測定通用的反映氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)(SOD含量、GSH活性和MDA含量)，并對MDA的含量與淋巴細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了相關(guān)性檢測，探討人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率在運(yùn)動后發(fā)生變化的可能機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

燕山大學(xué)參加運(yùn)動會萬米長跑的體育專業(yè)運(yùn)動員8名，均為健康男性。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集 運(yùn)動前1天、運(yùn)動后2h、24h和48h分別采集受試者外周靜脈血1ml，用500μL枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，取抗凝血1ml用于檢測淋巴細(xì)胞凋亡，其余抗凝血立即冰凍離心機(jī)離心，為測定抗氧化酶與脂質(zhì)過氧化水平備用。

1.2.2 血液淋巴細(xì)胞的提取和淋巴細(xì)胞凋亡率的檢測 取抗凝血1ml，與Hank’s液1∶1混勻后，小心加入到2ml的細(xì)胞分離液之液面上，以2 000rpm(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子) 15min，收集第二層細(xì)胞，放入含Hank’s液4ml的試管中，充分混勻后，以1 700rpm離心10min。吸去上清液，沉淀反復(fù)洗兩次得到淋巴細(xì)胞。

收集5×105細(xì)胞，加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5μl的Annexinⅴ－FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光反應(yīng)15min;在1h內(nèi)過300目尼龍網(wǎng)上流式細(xì)胞儀檢測。用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)光路，保證儀器CV值小于3%，488nm激光激發(fā)，用FS和SS設(shè)門，確定淋巴細(xì)胞群，分別收集525nm、620nm波長的熒光，分析陽性細(xì)胞的百分率。

1.2.3 抗氧化酶與脂質(zhì)過氧化水平的測定 SOD活性、MDA含量和GSH水平測定均嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書操作。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器和試劑

枸櫞酸鈉抗凝劑、淋巴細(xì)胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，Annexinⅴ－FITC雙染色試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，TDZ4－WS低速臺式離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，EPICSXL型流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，ECOM－F6124型半自動生化分析儀(德國EPPENDORF公司)。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計

用SPSS 15.0軟件對所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，選擇1－SampleK－S進(jìn)行正態(tài)檢驗，選擇One－Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，用mean±SD表示結(jié)果。用P＜0.05來表示數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 受試者的基本情況 見表1。

2.2 萬米長跑后人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的變化

與安靜狀態(tài)比較，運(yùn)動后2h和24h血漿淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)，運(yùn)動后2h顯著高于24h(P＜0.05)，48h基本恢復(fù)安靜水平，人體血漿淋巴細(xì)胞凋亡率在萬米長跑后的時序性變化特征見圖1;從血漿淋巴細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析圖(圖2)也可以看出同樣的趨勢。

表1 受試者基本情況一覽表

圖1 萬米跑后人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的時相變化

圖2 血液淋巴細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀分析圖

2.3 萬米長跑后人體外周血中SOD酶活性、GSH與MDA含量的變化

運(yùn)動前安靜時相比，萬米長跑后2h和24h人體血漿中SOD酶活性顯著升高(P＜0.01)，運(yùn)動后48h則五顯著變化(P＞0.05);與運(yùn)動后24h相比，運(yùn)動后48h人體血漿中SOD酶活性顯著下降(P＜0.05)。運(yùn)動前安靜水平相比GSH水平在運(yùn)動后2h顯著高升高(P＜0.05)，而運(yùn)動后24h和48h則無顯著差異(P＞0.05)。與運(yùn)動前安靜水平相比，MDA含量在運(yùn)動后2h和24h均顯著升高(P＜0.01)，而運(yùn)動后48h則無顯著差異(P＞0.05);與運(yùn)動后24h相比，運(yùn)動后2h顯著升高(P＜0.01)。運(yùn)動前后血漿中SOD酶活性、GSH與MDA含量的時相變化見圖3、圖4、圖5。

2.4 萬米長跑后人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率與MDA含量的相關(guān)性

如圖6所示，萬米長跑后人體血漿MDA含量與淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義(r:0.757;P:0.001)。

圖3 萬米跑后人體血漿中SOD的變化

圖5 萬米跑后人體外周血中MDA的變化

圖4 萬米跑后人體外周血中GSH的變化

圖6 人體外周血MDA含量與淋巴細(xì)胞凋亡率相關(guān)性檢驗

3 討論

細(xì)胞凋亡的概念在1972年由澳大利亞病理學(xué)家Kerr等首次提出［1］。近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點。細(xì)胞凋亡是一種具有特征形態(tài)和生化改變的細(xì)胞死亡過程，其意義在于多細(xì)胞生物通過這種特殊的細(xì)胞自殺行為對不同外界有害刺激時產(chǎn)生應(yīng)答，從而維持內(nèi)環(huán)境的平衡和生長發(fā)育，細(xì)胞凋亡持續(xù)發(fā)生在機(jī)體整個生命過程［6］。運(yùn)動作為一種外在刺激，勢必會影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，近年來的研究表明，多種運(yùn)動方式都可能引起機(jī)體的細(xì)胞凋亡率，而凋亡率變化也發(fā)生在多種組織細(xì)胞，比較普遍的觀點有急性、大強(qiáng)度運(yùn)動能引起多種組織細(xì)胞的凋亡率上升，其中包括免疫細(xì)胞［5］。MoorenFC等證實在力竭運(yùn)動后血淋巴細(xì)胞數(shù)目下降［7］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者也相繼發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動后胸腺細(xì)胞血淋巴細(xì)胞凋亡率顯著增加，認(rèn)為這可能是導(dǎo)致力竭運(yùn)動后免疫功能低下的主要原因［8］。

李靖等人對大鼠進(jìn)行一次性力竭游泳訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動能夠誘導(dǎo)大鼠淋巴細(xì)胞凋亡，且隨著疲勞加深凋亡細(xì)胞比例增大［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，萬米長跑后，人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率增加，這與前人的研究是相一致的，而淋巴細(xì)胞凋亡增加可能是免疫功能低下的原因之一;本研究還發(fā)現(xiàn)萬米長跑后人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡也呈現(xiàn)時相性特征，運(yùn)動后2h和24h人體外周血淋巴細(xì)胞凋亡率顯著高于運(yùn)動前安靜水平(P＜0.01)，運(yùn)動后2h高于24h(P＜0.05)，48h基本恢復(fù)。在運(yùn)動影響血液淋巴細(xì)胞凋亡率方面，其他學(xué)者也有相關(guān)報道，認(rèn)為運(yùn)動會導(dǎo)致運(yùn)動后血液中淋巴細(xì)胞的減少，Morren通過選取健康志愿者，并對他們進(jìn)行力竭性運(yùn)動實驗發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后即刻血液中的淋巴細(xì)胞凋亡率呈顯著性增長［7］。Mars等進(jìn)行力竭性跑步運(yùn)動實驗，在運(yùn)動后即刻、24h和48h取靜脈血，用TUNEL法染色志愿者的淋巴細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞術(shù)對凋亡率進(jìn)行檢測，與運(yùn)動前的相比，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動后即刻有63%的淋巴細(xì)胞、運(yùn)動后24h有86.2%的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡［9］。Umegaki等讓志愿者在跑臺上以85%VO2max的強(qiáng)度運(yùn)動30min，發(fā)現(xiàn)發(fā)生輕微的染色體損傷，而這種損傷能在次級氧化應(yīng)急的誘導(dǎo)下加強(qiáng)［10］。劉曉莉等人通過DNA損傷檢測實驗也間接說明了大強(qiáng)度耐力運(yùn)動對細(xì)胞凋亡的影響及其時序性［11］。而這種時序性特征也被國外不少學(xué)者的研究證實［12－13］。這些研究均直接或間接地證明了大強(qiáng)度耐力運(yùn)動對機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞的凋亡有誘發(fā)作用，從而在一定程度上解釋了長時間大強(qiáng)度運(yùn)動后機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少。而大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后引起細(xì)胞的凋亡具有一定的時序性，與本研究的時序性特征具有一致性。與Pedersen的“Open Windows”理論也具有對應(yīng)性。表明機(jī)體在大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后，免疫能力會大大降低，而這個低下期可能持續(xù)24h左右。但也有研究認(rèn)為運(yùn)動后淋巴細(xì)胞數(shù)量減少并不是由淋巴細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的，但大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后機(jī)體免疫能力的下降得到了諸多學(xué)者的公認(rèn)。

機(jī)體在有氧代謝過程中產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但這種平衡狀態(tài)很容易被外界的刺激打破，從而導(dǎo)致ROS代謝失衡，ROS對機(jī)體產(chǎn)生損害作用，反映到機(jī)體就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激(oxidative stress)，SOD酶活性、GSH水平常用來作為反映機(jī)體的抗氧化能力，MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物其含量經(jīng)常可以間接代表組織發(fā)生氧化損傷的程度。研究認(rèn)為大強(qiáng)度耐力運(yùn)動會使機(jī)體組織缺血、缺氧、ATP分解加速，使得cAMP生成增加，在黃嘌呤氧化酶作用下產(chǎn)生超氧陰離子自由基，同時線粒體呼吸鏈電子傳遞加快，使呼吸鏈產(chǎn)生大量的自由基，從而使機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)被打破，大量的自由基攻擊細(xì)胞膜，造成細(xì)胞凋亡［14－15］。本實驗結(jié)果表明，萬米長跑運(yùn)動后2h和24h，人體外周血中SOD酶活性與運(yùn)動前水平相比顯著升高，GSH水平在運(yùn)動后2h與運(yùn)動前水平相比顯著升高，這可能是機(jī)體加快自由基清除的代償性反應(yīng)，而對應(yīng)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量發(fā)生顯著變化。萬米長跑運(yùn)動引起體內(nèi)ROS自由基生成增多，導(dǎo)致運(yùn)動性氧應(yīng)激和膜脂質(zhì)過氧化，而已有的研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡與自由基誘導(dǎo)細(xì)胞膜上的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，自由基誘導(dǎo)細(xì)胞膜凋亡通路打開［16］。機(jī)體因ROS自由基的失衡造成內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)一旦被打破，再次恢復(fù)平衡需要一定的時間，因此在運(yùn)動后24h時血液仍保持較高的氧化應(yīng)激水平。隨著時間的增加，機(jī)體的ROS自由基的清除，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)到平衡狀態(tài)。而從機(jī)體MDA含量與淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)性(r:0.757;P:0.001)可以看出，機(jī)體在大強(qiáng)度耐力運(yùn)動后，外周血淋巴細(xì)胞凋亡的可能與大強(qiáng)度耐力運(yùn)動產(chǎn)生大量的氧自由基有關(guān)。可以推斷，機(jī)體在大強(qiáng)度耐力運(yùn)動的Open Windows與大量自由基的產(chǎn)生有很大關(guān)系。當(dāng)然，運(yùn)動后淋巴細(xì)胞的凋亡程度也會隨著運(yùn)動方式、運(yùn)動量以及組織器官的不同而有差異性［3］，所以目前來看，有關(guān)大強(qiáng)度運(yùn)動引起淋巴細(xì)胞凋亡時序性的研究結(jié)果還存在差異性，詳細(xì)而準(zhǔn)確的時序結(jié)論還需要更多的實驗驗證。

4 結(jié)論

萬米長跑對外周血淋巴細(xì)胞凋亡率有誘發(fā)效應(yīng)，運(yùn)動后凋亡率隨時間的變化呈現(xiàn)“開窗理論”特征。萬米長跑后外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的增加可能是機(jī)體免疫能力下降的原因。大強(qiáng)度耐力運(yùn)動引起的機(jī)體自由基代謝失衡可能是淋巴細(xì)胞凋亡率變化的原因之一。

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Effect of Lymphocytes Apoptosis and Oxidative Stress on Human Peripheral Blood Induced by 10 000meter Running

XU Guoxi
(Department of PE，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)

object:we investigated the lymphocytes apoptosis and the level of anti-oxidative status on human serum in different times after ten-thousand-meter running，and discussed the mechanism of lymphocytes apoptosis induced by endurance exercise．Method:We selected eight healthy male athletes，who participated in ten-thousand meter running in sports games．The subjects were tested twenty-four hours before exercise and 2 hours，24hours and 48 hours after exercise．We investigated the lymphocytes apoptosis on human peripheral blood by flow cytometry and detected the level of SOD，GSH and MDA in serum．Results:The results have showed that the lymphocytes apoptosis on peripheral blood cell significantly increased 2h and 24h after exercise and 2h it was significant higher than 24h．It reduced to the level of pre-exercise after 48 hours．The activity of SOD and the content of GSH and MDA in serum increased significantly at 2h compared with the pre-exercise，and SOD activity and MDA content were still significant higher than the pre-exercise．The changes of the indexes in serum at 48h had no significant difference compared with pre-exercise．A negative correlation was found between MDA and the rate of lymphocyte apoptosis．Conclusions:ten-thousand-meter running induces have effects on rates of peripheral blood lymphocytes，and the apoptosis rate changes over time show“open windows”feature．Exercise-induced metabolic imbalance of free radicals might be one of the lymphocytes apoptosis mechanisms．

lymphocytes apoptosis;oxidative stress;peripheral blood;ten-thousand-meter running

G804.7

A

1004－0560(2011)04－0086－04

2011-05-12;

2011-06-19

河北省科技廳資助項目(11457201D－10)。

許國喜(1963－)，男，副教授，學(xué)士，主要研究方向為學(xué)校體育與健康。

責(zé)任編輯:喬艷春

?體育教育訓(xùn)練學(xué)