磺胺甲惡唑和甲氧芐氨嘧啶在土壤中的好氧降解及對微生物呼吸的影響*

巫 楊 陳東輝 SMITH Lester KOOKANA Rai

(1.東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海，201620;2.上海應用技術(shù)學院，上海，200235;3.CSIRO Land and Water，Adelaide，5064，Australia)

磺胺甲惡唑和甲氧芐氨嘧啶在土壤中的好氧降解及對微生物呼吸的影響*

巫 楊1陳東輝2＊＊SMITH Lester3KOOKANA Rai3

(1.東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海，201620;2.上海應用技術(shù)學院，上海，200235;3.CSIRO Land and Water，Adelaide，5064，Australia)

實驗研究了抗生素藥物在不同土壤中(不同種類以及有無添加牛糞)的降解行為，同時采用基質(zhì)誘導呼吸法考察了藥物在土壤中對微生物呼吸的影響.結(jié)果表明，添加牛糞的土壤在前20 d內(nèi)輕微促進了磺胺甲惡唑的降解效率，磺胺甲惡唑的快速降解主要是微生物作用引起，而甲氧芐氨嘧啶則在好氧條件下表現(xiàn)出較強的持久性.同控制土壤樣品對比，藥物對土壤微生物呼吸的短暫抑制作用出現(xiàn)在前2 d，隨后快速恢復.100 d后，在添加不同濃度，單體或混合物的抗生素土壤中，總的礦化程度無較大差異.這表明2種抗生素的不同濃度，單獨或混合的添加方式，100 d后對微生物呼吸造成的影響較小.

磺胺甲惡唑，甲氧芐氨嘧啶，好氧降解，礦化，微生物呼吸.

藥物抗生素廣泛用于人體和獸藥中，許多藥物不能被有機體完全代謝，大量未被利用的母體化合物及代謝產(chǎn)物可能通過各種不同的方式進入環(huán)境中.自1970年以來，環(huán)境中抗生素的相繼檢出及涉及到的環(huán)境風險引起了重視，這些在環(huán)境中殘留累積的藥物可能導致耐藥菌的出現(xiàn)，以及越來越多的致病菌分子結(jié)構(gòu)的重組［1-3］.磺胺甲惡唑(SMX)是一種在全球廣泛使用的磺胺類藥物，通常和甲氧芐氨嘧啶(TRM)以5∶1的質(zhì)量比聯(lián)用，用來治療由微生物引起的人體感染.此外，它們也常用作獸藥，用來預防和治療牲畜疾病及用作生長催化劑［4-7］.近些年來，許多研究關注于SMX和TRM在不同環(huán)境母體中的痕量檢測，在眾多的污水處理廠、生物固體、沉積物、牲畜糞便、土壤及地下水中已經(jīng)被相繼報道檢出［8-10］.一些報道指出SMX不容易被生物降解，然而，同樣有一些報道指出SMX暴露于碳源和氮源下，在鹽性和淡水污泥、河底沉積物中可以得到較大程度降解.同SMX一樣，TRM的生物降解也具有高度的變動性，且取決于不同的去除條件［9-10］.Gulkowska等人［11］觀察到在不同的污水處理廠，TRM的去除效率不同.此外，Gobel等人［12-13］報道了TRM在瑞士某傳統(tǒng)的污水處理廠中，初級和二級污水處理過程中沒有明顯的去除作用，在另外一些污水處理廠中卻發(fā)現(xiàn)了明顯的去除效果.盡管如此，當前對于SMX和TRM在土壤中的環(huán)境行為研究報告還較少，含有這些抗生素且處于一定污染水平的動物糞便和生物固體常被用作肥料施于土壤，進而可能對土壤生態(tài)系統(tǒng)造成影響.

本文研究目的是為了調(diào)查SMX和TRM在3種添加及未添加牛糞的土壤中，在好氧狀態(tài)下的降解過程，同時對土壤中添加不同濃度水平的SMX及SMX和TRM的混合物可能給微生物呼吸帶來的影響進行了評估.

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

實驗中所用的SMX、TRM藥物購買于Sigma公司.化合物均為分析純.藥物的理化性質(zhì)如下:SMX分子量為 253.28，lgKow為 0.89，水中溶解度為0.6 g·L－1，pKa為 1.7/5.6.TRM 分子量為290.32，lgKow為 0.91，水中溶解度為0.3— 0.4 g·L－1，pKa為 1.3/7.4.儲備溶液均配制溶于甲醇中(分析純).

1.2 土壤及牛糞

實驗所選用的土壤LB、MT和BL分別來自澳大利亞不同區(qū)域，取樣深度在0—15 cm.所取土樣在自然條件下風干并過2 mm篩.土壤的理化性質(zhì)如表1所示.牛糞收集于澳大利亞當?shù)鼐用窦遗Ｈ?37.8%C，2.3%N，pH 8.19).在使用之前，牛糞在25℃ 下自然風干，然后磨成細碎狀.在進行實驗之前，通過LC-ESI-MS/MS檢測，所選用土壤和牛糞沒有發(fā)現(xiàn)目標化合物的存在.

表1 實驗所用3種土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of three soils used in the study

1.3 好氧生物降解實驗及土壤呼吸基質(zhì)誘導實驗(SIR)

好氧降解實驗中，稱取5 g土壤或5 g土壤+0.2 g牛糞的土壤放入30 mL的玻璃容器中，土壤濕度被調(diào)節(jié)到該土壤的最大持水量的60%.SMX和 TRM在土壤中的添加量分別為10 mg·kg－1和2 mg·kg－1.然后將容器敞口放入層流通風櫥中，讓甲醇得以充分揮發(fā).稱重檢查并補加水分損失后，將容器蓋疏松蓋上，放置在(25±3)℃的暗室內(nèi)并以鋁箔紙包住(防止光降解).在整個培養(yǎng)期間，每周打開容器蓋子2次，搖晃并鼓入空氣，同時檢查并補充水分損失.所有的滅菌控制樣品在連續(xù)3 d內(nèi)，于121 ℃滅菌室內(nèi)滅菌30 min.在選定時間間隔內(nèi)(0、4、10、20、40、60、80、100 d)，測定土壤中殘留物濃度.在所有實驗進行之前，單一土壤和牛糞添加過的土壤均被預培2周.所有樣品做3次重復.

為了研究所選藥物對微生物呼吸的抑制作用，在好氧狀態(tài)下，向單一的3種土壤中添加不同濃度的SMX及SMX和TRM的混合溶液，使其在土壤中的濃度分別為10 mg·kg－1SMX、100 mg·kg－1SMX、10 mg·kg－1SMX+2 mg·kg－1TRM、100 mg·kg－1SMX+20 mg·kg－1TRM.在開始實驗前，10 g 土壤加入50%的最大持水量的超純水預先培養(yǎng)2周，然后分別添加SMX和TRM的儲備溶液，以達到上述土壤中所需濃度.添加0.1 mL的14C-葡萄糖，額外的碳源D-葡萄糖(2000 μg·g－1)到土壤中，土壤濕度添加到最終60%最大持水量.實驗過程中控制樣品也包含在內(nèi)(未加藥空白).土壤容器每周打開搖晃鼓入空氣一次，并適時補充土壤濕度損失以維持原先狀態(tài).土壤在生化培養(yǎng)箱里25℃下進行培養(yǎng)，釋放出來的14CO2通過 1 mol·L－1NaOH 吸收液吸收.吸收液采樣時間為 0(5 h)、1、2、5、8、15、29、43、71、100 d.每次采樣過后，更換新的NaOH吸收槽.實驗做3次重復.14CO2用Perkin Elmer液能閃爍計數(shù)儀 (Tri-Carb 3110 TR)進行含量測定以比較礦化程度.

1.4 提取和分析方法

樣品加入10 mL的混合溶劑(甲醇/EDTA-Mcllvaine 1∶1，pH=4).加蓋封緊，將樣品渦旋混勻10 s，置于搖床緩慢搖晃10 min，超聲10 min.樣品在離心機下以3500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液，整個提取過程重復3次.最后合并收集到的上清液用超純水稀釋到400 mL.固相萃取柱(Strata X cartridge，polymeric reverse phase，6 mL/200 mg)進行凈化富集:Strata X柱使用前用2×3 mL甲醇、2×3 mL超純水進行預處理，萃取富集后，用2×3 mL超純水清洗柱壁，然后在真空下干燥15 min，分3次依次加入2 mL、2 mL、1 mL甲醇洗脫柱子，收集洗脫液，在LC-ESI-MS/MS分析進樣前，稀釋到一定倍數(shù)用作藥物殘留濃度分析.HPLC色譜分離使用Thermo Scientific Surveyor分析儀器.色譜分離柱選用Hypersil ODS-2μm，150 mm×2.6 mm(Thermo Scientific).流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸溶于10 mmol·L－1的乙酸銨溶液(1 L).采用的梯度為:A起始于20%，持續(xù)3 min，在2 min后增加到50%，再在0.1 min內(nèi)增加到90%，持續(xù)2.9 min，然后在0.1 min內(nèi)降低到20%，3.9 min用來平衡.流動相速率為0.2 mL·min－1.回收率檢測做3次平行.在3種單一土壤和牛糞添加過的土壤中注入1 mg·kg－1或200 μg·kg－1的 SMX、TRM，回收率分別為 SMX(71 ±5)%—(80 ±8)%(干重)，TRM(60 ±9)%—(72 ±7)%(干重).

1.5 動力學模型

采用Wang等人［14］建立的調(diào)整后的一級動力學模型.此模型公式表達為:

式中，C0和Ct分別為時間0和時間t時對應的濃度.a被稱作可用系數(shù)，為正值.k為反應速率常數(shù).

目標化合物50%的降解時間(DT50)可用以下公式進行計算:

2 結(jié)果與討論

2.1 SMX和TRM的好氧降解

SMX和TRM的降解過程見圖1，好氧降解下的動力學參數(shù)如表2所示.

圖1 SMX和TRM在土壤中(有無牛糞添加)的好氧降解(N.S=未滅菌，S.T=滅菌)Fig.1 Aerobic degradation of SMX and TRM in soils with and without manure amendment(N.S=Non-sterile，S.T=Sterile)

檢測數(shù)據(jù)表明，在未滅菌的單一土壤或牛糞添加過的土壤中，SMX和TRM的降解速率常數(shù)要明顯高于滅菌的樣品，因此可以推測在這3種土壤中，微生物的活動對藥物的降解起到了重要作用.結(jié)果和Accinelli等人［15］的研究結(jié)果相一致，在其實驗中發(fā)現(xiàn)了微生物的活動對一組磺胺類藥物在土壤中降解的重要性.此實驗中看出，SMX和TRM在未滅菌的，牛糞添加過的土壤的降解速率常數(shù) (kSMX=0.1077—0.2401 d－1;kTRM=0.0066—0.0503 d－1)高于未滅菌的，單一的土壤 (kSMX=0.0776—0.1582 d－1;kTRM=0.0053—0.0322 d－1).SMX 和 TRM 在未滅菌，牛糞添加過或未添加過的土壤中，50%的降解時間快慢均遵循以下順序:LB(8.3%OC)＞BL(4.7%OC)＞MT(4.0%OC).這說明在好氧降解過程中，有機碳含量的重要性.在土壤中，有機質(zhì)含量是維持微生物活動的主要來源，它可以增加土壤的松散能力和滲透性，從而給微生物生長繁殖提供更好的條件.此外，數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在未被滅菌的單一土壤和牛糞添加過土壤中，對SMX和TRM的快速降解均發(fā)生在前20 d內(nèi)，然后降解速率放緩.與所有未滅菌樣品進行對比發(fā)現(xiàn)，SMX和TRM在滅菌過后的對照樣品中出現(xiàn)一定程度的濃度下降.因此，非生物降解因素在藥物的降解過程中不可忽略，降解過程由生物因素和非生物因素共同作用.在滅菌樣品中的藥物濃度損失同樣也被Yang等人［16］在實驗中發(fā)現(xiàn).非生物因素可能涉及到多方面原因.Bialk和Stoob等人［17-18］曾報道了磺胺類藥物和有機質(zhì)的共價健結(jié)合，可能導致不可逆的吸附，從而導致生物利用率的降低.此外，土壤中礦物、金屬氧化物等都有可能影響到非生物降解.

表2 好氧降解過程中的改進動力學模型的參數(shù)Table 2 Fitting results of aerobic degradation using availability-adjusted model

2.2 土壤添加SMX和TRM對微生物呼吸的影響

圖2呈現(xiàn)了在3種對比土壤中，添加不同濃度水平的單一SMX、SMX和TRM的混合物對微生物呼吸的影響.研究發(fā)現(xiàn)，在前2 d的采樣時間內(nèi)，與空白樣品比較，在3種添加藥物后的對比土壤中均發(fā)生了明顯的抑制呼吸效應(礦化效應).2 d后，反抑制效應出現(xiàn)，土壤呼吸能力快速恢復.這與Thiele-Bruhn等人［19］曾指出藥物抗生素可能對土壤微生物活性產(chǎn)生暫時選擇性抑制的報道相一致.在前2 d內(nèi)，土壤中的有機碳含量與添加藥物而產(chǎn)生土壤呼吸抑制作用相關.在添加了混合藥物的沙質(zhì)土(MT)中，在2 d內(nèi)引起的土壤呼吸抑制效應顯著高于僅添加SMX單體的情況.隨著有機碳含量的增加，在BL和LB土壤中，添加混合藥物后的抑制效應和僅添加單體SMX的差別已不再明顯.2 d后土壤呼吸能力快速恢復，這可能與土壤中母體化合物的生物轉(zhuǎn)化，短時間內(nèi)SMX及TRM對土壤成分結(jié)合能力損失有關.

圖2 SMX和TRM在3種土壤中的礦化效應Fig.2 The effect of SMX and TRM on mineralization in three soils

經(jīng)過100 d后培養(yǎng)，計算了每種土壤總礦化率.數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與空白樣品對比，在3種土壤LB、BL、MT中，最大的差異均發(fā)生在添加100 mg·kg－1SMX和20 mg·kg－1TRM的土壤，其與空白樣品礦化差別分別為(8±1)%、(7±1)%和(5±3)%.由于實驗中所用藥物劑量均明顯高于環(huán)境中實際水平，因而在實際環(huán)境中的藥物殘留水平(ng·kg－1—μg·kg－1)［1，20］對土壤微生物呼吸的抑制作用幾乎可以忽略.目前SMX和TRM對土壤種群結(jié)構(gòu)的影響研究較少，今后仍然有必要去弄清SMX和TRM對土壤成分帶來的變動效應，及土壤中母體化合物及代謝產(chǎn)物在不同作物中的累積效應.

3 結(jié)論

本研究一方面關注了SMX和TRM在3種添加和未添加牛糞的土壤中，在好氧條件下的降解行為.實驗結(jié)果可用改進后的一級動力學模型進行描述，而SMX的降解過程比TRM更符合這個模型.在好氧條件下，微生物活動對于這兩種化合物的降解都起到重要的作用.然而由于在滅菌樣品中連續(xù)的濃度損失，所以非生物因素仍然不可忽視.另一方面，基質(zhì)誘導呼吸實驗發(fā)現(xiàn)，與空白樣品對比，明顯的微生物呼吸抑制作用發(fā)生在前2 d內(nèi)，但100 d后在3種不同土壤中，總的百分比礦化率沒有呈現(xiàn)顯著差異.將來實驗需進一步調(diào)查SMX和TRM在牛糞中的降解行為，并考慮不同影響因素.另外，在添加或未添加牛糞的土壤中的藥物生物轉(zhuǎn)化途徑，以及土壤中土著微生物是否在藥物作用下轉(zhuǎn)換成耐性更強的物種仍待研究.

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AEROBIC DEGRADATION OF SULFAMETHOXAZOLE AND TRIMETHOPRIM AND EFFECT ON MICROBIAL RESPIRATION IN SOILS

WU Yang1CHEN Donghui2SMITH Lester3KOOKANA Rai3

(1.School of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai，201620，China;2.Shanghai Institute of Technology，Shanghai，200235，China;3.CSIRO Land and Water，Adelaide，5064，Australia)

In this study，the degradation of antibiotics under aerobic conditions in three different soils with and without manure addition was investigated.The effect on microbial respiration in soils was also investigated using substrate-induced respiration.The results showed that manure addition slightly accelerated aerobic degradation of sulfamethoxazole in the first 20 days.Sulfamethoxazole was degraded rapidly mainly through microbial degradation，while trimethoprim was more persistent under aerobic conditions.Obvious respiration suppression by these antibiotics occurred in the first 2 days compared to control soils，but a quick recovery appeared later.There was no significant concentration-dependent inhibition on the total mineralization of soils after spiking with sulfamethoxazole or sulfamethoxazole combined with trimethoprim after 100 days，indicating no influence on microbial respiration regardless of the antibiotic concentrations，single compound or mixture added in soils.

sulfamethoxazole，trimethoprim，aerobic degradation，mineralization，microbial respiration.

2011年4月17日收稿.

*中國教育部-澳大利亞聯(lián)邦科工組織聯(lián)合培養(yǎng)博士生項目資助

＊＊通訊聯(lián)系人，Tel:13341688399;E-mail:chdonghui@163.com