脂肪酶催化棕櫚酸和大豆磷脂的酸解反應(yīng)研究

班婷婷，曹 棟，陳國安，張顯久

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇無錫214122）

脂肪酶催化棕櫚酸和大豆磷脂的酸解反應(yīng)研究

班婷婷1，曹 棟1，陳國安2，張顯久2

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.無錫江大百泰科技有限公司，江蘇無錫214122）

以大豆磷脂為原料，Lipozyme TL IM為酶試劑，正己烷為溶劑，棕櫚酸為?；w，對(duì)大豆磷脂和棕櫚酸進(jìn)行酶法酸解研究。通過實(shí)驗(yàn)得出較優(yōu)的反應(yīng)條件：液料比（正己烷/磷脂）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂）5∶1，加酶量（以底物總量為準(zhǔn)）20%，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60h，水分添加量（以酶量為準(zhǔn)）2%，該條件下驗(yàn)證得磷脂中棕櫚酸的含量可達(dá)到34.45%。

大豆磷脂，棕櫚酸，脂肪酶，酸解

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆磷脂 北京華清美恒天然產(chǎn)物技術(shù)開發(fā)有限公司；固定化脂肪酶Liposome TL IM 諾維信公司；棕櫚酸 CP級(jí)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；丙酮、氯仿、冰醋酸、正己烷、乙醚、三氟化硼、氫氧化鈉、甲醇 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，色譜純。

GC-14B氣相色譜儀 日本島津；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申科生物科技有限公司；CS501型超級(jí)恒溫水浴 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；78HW-1磁力攪拌器 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；SHB-!循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酸解的方法 按底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，n/n）稱取一定量的棕櫚酸和磷脂置于100mL的錐形瓶中，加入一定量的溶劑，混勻后按加酶量（酶/底物，m/m）加入脂肪酶，在特定的溫度下密封反應(yīng)一定時(shí)間后，加入氯仿-甲醇（2∶1，V/V），振蕩浸提，抽濾除去酶后脫溶。冷卻后加入適量丙酮反復(fù)洗滌產(chǎn)物，直至TLC分析無游離脂肪酸殘留為止。55℃真空干燥脫去殘留丙酮，樣品低溫保存，待分析。

1.2.2 薄層層析TLC 以氯仿-甲醇-水=65∶25∶4（V∶V∶V）為展開劑，浸入展開劑的深度距離薄板底邊0.5～1.0cm。展開至要求距離，取出薄板晾干，顯色劑顯色，呈紫紅色［11］。

1.2.3 氣相色譜分析磷脂的脂肪酸組成 氣相色譜分析前，制備脂肪酸甲酯。具體方法如下：稱取0.1g左右的試樣，置于10mL的試管中，加入2mL的0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液，60℃恒溫水浴中皂化30min以上，冷卻后，加入2mL的BF3-甲醇（1∶3，V/V）溶液，70℃恒溫水浴中酯化5min，加入1mL的正己烷和2mL飽和NaCl溶液，萃取分層后取出上層清液加入少量無水硫酸鈉。

氣相色譜條件：檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；毛細(xì)管柱：CP-Si188，100m×0.25mm；膜厚：0.2"m；溫度：檢測器（250℃），進(jìn)樣口（250℃）；程序升溫：起始溫度170℃保持3min，以3℃/min的速度升至215℃，保持30min；載氣類型：N2，50kPa；進(jìn)樣量：1"L；氫氣：60kPa；空氣：50kPa；衰減：1；分流比：1∶50。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系選擇

2.1.1 溶劑的選擇 考察石油醚、正己烷、氯仿、甲苯、四氯化碳、苯，幾種常見的溶劑對(duì)磷脂酸解的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（溶劑/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溶劑對(duì)反應(yīng)的影響

水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)，但對(duì)于大多數(shù)有機(jī)化合物來說，在水介質(zhì)中難溶或不溶。由此產(chǎn)生了使用有機(jī)溶劑取代溶劑水，形成固相酶分散在有機(jī)溶劑中的體系。

研究表明酶的結(jié)構(gòu)在水相和有機(jī)相中并沒有顯著的變化［13］，一定量的水維持酶正確構(gòu)象是必需的，真正的非水體系中酶是沒有催化活性的，實(shí)現(xiàn)酶的天然結(jié)構(gòu)和功能只需要非常少量的水，即所謂的微水環(huán)境［13-14］。

溶劑會(huì)影響酶的活力，主要是由于溶劑影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而改變酶的催化活性。溶劑分子與蛋白質(zhì)分子表面殘基上的水分子之間產(chǎn)生的靜電引力越強(qiáng)，溶劑極性越強(qiáng)，相對(duì)的，蛋白分子和水分子的靜電引力越弱，使水分子從酶分子表面脫落，進(jìn)入溶劑體系中而導(dǎo)致酶失活。而非極性的溶劑則有利于維持酶的微水環(huán)境。

用logP值來衡量溶劑的疏水性，即溶劑在正辛醇與水之間的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值，logP越大，溶劑疏水性越強(qiáng)［15］。在所使用的六種有機(jī)溶劑中，正己烷的logP=3.5，四氯化碳的logP=3.0，有利于維持酶的微水環(huán)境，使酶保持最佳的伸展?fàn)顟B(tài)，從而表現(xiàn)出較高的活性；其他幾種溶劑logP均小于3，破壞了酶分子周圍的水層，使酶分子處于蜷縮狀態(tài)，抑制了酶的活性。

另一方面，溶劑直接或間接地與底物和產(chǎn)物相互作用，進(jìn)而影響酶的活力。底物必須滲入必需水層，產(chǎn)物移出此水層，才能使反應(yīng)繼續(xù)下去，溶劑能改變酶分子必需水層中底物或產(chǎn)物的濃度，直接影響到反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)平衡。溶劑的疏水性太強(qiáng)，底物不容易從溶劑擴(kuò)散至酶分子表面，間接影響酶的活力。logP在2.0～3.5之間，就可以達(dá)到較高的活性［16］。因此，最終選擇正己烷作為反應(yīng)溶劑。

2.1.2 pH的影響 考察pH對(duì)磷脂酸解的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖2所示。

酶的催化活性取決于其帶電官能團(tuán)的正確的離子化狀態(tài)。在水溶液中，這些官能團(tuán)的離子化狀態(tài)取決于溶液的pH。有機(jī)溶劑不會(huì)改變酶蛋白帶電基團(tuán)的離子化狀態(tài)，因此酶在有機(jī)溶劑中的離子狀態(tài)就與從中提取該酶的水溶液中的離子狀態(tài)保持一致，有機(jī)溶劑酯交換反應(yīng)的最適pH與水中酶的最適pH大致相同［13-14］。因此可以將酶顆粒懸浮于不同的pH水溶液中，冷凍干燥后加入有機(jī)溶劑中，考察不同pH的影響［17］。由圖2所示，酶在pH9左右活力最高。以下實(shí)驗(yàn)中，酶的pH均調(diào)節(jié)為9，不再做詳細(xì)的說明。

圖2 pH對(duì)反應(yīng)的影響

酶要表現(xiàn)活性，它活性部分的有關(guān)基團(tuán)都必須選取一定的解離狀態(tài)，其中任何一種基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生了變化就將使酶從活性狀態(tài)轉(zhuǎn)入無活性狀態(tài)，或是從無活性轉(zhuǎn)入活性狀態(tài)，pH改變了酶的活性中心或是與之有關(guān)的基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而表現(xiàn)出不同的酶活性［14］。

2.2 主要因素對(duì)磷脂酸解的影響

2.2.1 液料比對(duì)磷脂酸解的影響 考察液料比對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)反應(yīng)的影響

由圖3可知，開始階段，隨著正己烷/磷脂比例的增大，即溶劑添加量的增多，棕櫚酸的含量呈增長趨勢，直至正己烷/磷脂達(dá)到5∶1后，棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定，隨后又呈略微下降趨勢。

液料比直接影響底物的濃度，在底物濃度低時(shí)，分子的運(yùn)動(dòng)空間較大，同一時(shí)間內(nèi)，底物和酶碰撞的幾率較小，只有少部分的酶分子和底物分子結(jié)合，溶液中還有較多的未結(jié)合的分子。隨著濃度的增加，愈來愈多的底物與酶結(jié)合，反應(yīng)速度加快，產(chǎn)物的含量逐漸增大。一旦所有的酶分子與底物相結(jié)合后（酶被底物飽和），進(jìn)一步增加底物濃度不能提高反應(yīng)速度。當(dāng)濃度過高時(shí)，轉(zhuǎn)化率降低，這是由于底物濃度過高，分子的擴(kuò)散速度降低，底物和產(chǎn)物相互包埋，一定程度上增大了產(chǎn)物分子離開酶的結(jié)合位點(diǎn)的空間位阻，反應(yīng)速度降低。因此，液料比控制在5∶1較為合適。

2.2.2 底物摩爾比對(duì)磷脂酸解的影響 考察底物摩爾比對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響

由圖4可知，隨著摩爾比增加，脂肪酸相對(duì)含量增大，提高了脂肪酸與磷脂結(jié)合的幾率，同時(shí)從反應(yīng)平衡角度看，反應(yīng)向正方向進(jìn)行。當(dāng)?shù)孜锬柋葹?∶1，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，磷脂充分地與棕櫚酸進(jìn)行酶促反應(yīng)。隨著棕櫚酸的繼續(xù)增加，反應(yīng)體系粘度過高，致使產(chǎn)物和底物的擴(kuò)散系數(shù)下降；同時(shí)也可能使酶周圍的水相酸化，導(dǎo)致酶活的降低或是部分失活，使得棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨摩爾比增加反而呈現(xiàn)減少的趨勢。所以，底物摩爾比應(yīng)控制在5∶1。

2.2.3 加酶量對(duì)磷脂酸解的影響 考察加酶量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖5所示。

圖5 加酶量對(duì)反應(yīng)的影響

增加酶的用量可以縮短達(dá)到相同酯化率所需的反應(yīng)時(shí)間，但同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)成本。由圖5所示，棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著脂肪酶添加量的增加而增大，直至脂肪酶添加量為20%時(shí)，反應(yīng)趨于平衡。脂肪酶添加量5%～20%時(shí)，酶量較少，溶液中存在大量未與酶結(jié)合的底物，這一階段的反應(yīng)速率主要由酶的濃度決定，反應(yīng)速率隨酶量的增加而加快。當(dāng)加酶量到達(dá)20%時(shí)，底物分子都與酶分子結(jié)合，繼續(xù)增加酶的用量，反應(yīng)速率基本不變，這是由于這一階段的反應(yīng)速率主要由底物濃度決定，而實(shí)驗(yàn)條件中底物濃度是恒定不變的，因此棕櫚酸的含量呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢。從反應(yīng)的趨勢和成本兩個(gè)方面考慮，加酶量以20%為宜。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)磷脂酸解的影響 考察反應(yīng)溫度對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)時(shí)間24h，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖6所示。

酶促反應(yīng)受溫度的影響較大，一方面，溫度升高，反應(yīng)速率加快；另一反面，溫度過高，使酶蛋白變性而失活。由圖6所示，反應(yīng)在50～65℃范圍內(nèi)，產(chǎn)物中棕櫚酸的含量隨溫度的升高而增加，在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，溫度升高，反應(yīng)速率加快，升至酶的最適溫度時(shí)，酶具有最高的催化活性。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，高溫使一部分酶發(fā)生變性，酶的催化活性減弱，反應(yīng)速率降低，表現(xiàn)為產(chǎn)物中棕櫚酸的含量降低。由分析可得出，脂肪酶TLIM催化磷脂酸解的最佳溫度為65℃。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)棕櫚酸酸解的影響 考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，水分添加量（水/酶，g/g）0%，結(jié)果如圖7所示。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

由圖7可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，更多的游離脂肪酸和磷脂發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物中棕櫚酸的含量隨時(shí)間的延長而增長；60h后，時(shí)間進(jìn)一步延長，整個(gè)反應(yīng)體系趨向于平衡狀態(tài)，棕櫚酸的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長而無法實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的增加。較長時(shí)間反應(yīng)，甚至?xí)斐僧a(chǎn)物部分水解，降低了終產(chǎn)物的得率。結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，反應(yīng)時(shí)間選擇60h較為合適。

2.2.6 加水量對(duì)磷脂酸解的影響 考察加水量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響，其他反應(yīng)條件為液料比（正己烷/磷脂，mL/g）5∶1，底物摩爾比（棕櫚酸/磷脂，mol/mol）5∶1，加酶量（酶/總底物，g/g）20%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h，結(jié)果如圖8所示。

圖8 水分添加量對(duì)反應(yīng)的影響

由圖8所示，棕櫚酸的含量變化不大，水分添加量為2%時(shí)，足以使酶表現(xiàn)出較高的活性。只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少與酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。

含水量影響酶分子的剛性與柔性，酶在催化反應(yīng)時(shí)，必須有一定的柔性，以使酶能趨向于最佳催化狀態(tài)所需的構(gòu)象變化。當(dāng)含水量降低時(shí)，蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)之間靜電作用加強(qiáng)，會(huì)使酶的剛性增加，酶活降低，其活性部位會(huì)變得較難接受體積較大的底物。含水量過高，酶的柔性過大也會(huì)引起酶的失活。只有達(dá)到最適水量，酶結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性與熱力學(xué)穩(wěn)定性之間達(dá)到平衡，酶的活力才最大，所以水分添加量為2%較合適。

2.3 磷脂脂肪酸組成的分析

根據(jù)脂肪酸的出峰規(guī)律：不同碳原子數(shù)的脂肪酸甲酯，碳原子數(shù)少的先出峰；相同碳原子數(shù)的脂肪酸甲酯，雙鍵少的先出峰，在本實(shí)驗(yàn)氣相色譜檢測條件下，脂肪酸的出峰順序分別為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終得出較優(yōu)的反應(yīng)條件為正己烷/磷脂5∶1，底物摩爾比5∶1，加酶量20%，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60h，加水量2%，使得棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由15.29%上升至34.45%。由圖9和圖10所示，保留時(shí)間在11min左右棕櫚酸的含量明顯增加。

圖9 原料磷脂的脂肪酸組成氣相色譜圖

圖10 反應(yīng)后磷脂的脂肪酸組成氣相色譜圖

3 結(jié)論

通過脂肪酶Liposome TL IM催化可制得富含棕櫚酸的結(jié)構(gòu)化磷脂。單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，得出的較優(yōu)條件為正己烷/磷脂5∶1，底物摩爾比5∶1，加酶量20%，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60h，加水量2%，該條件下驗(yàn)證得到產(chǎn)物中棕櫚酸的含量為34.45%。

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Lipase-catalyzed acidolysis of palmitic and soybean phospholipids

BAN Ting-ting1，CAO Dong1，CHEN Guo-an2，ZHANG Xian-jiu2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Southern Yangtze University Biotech Co.，Ltd.，Wuxi 214122，China）

With soybean phospholipids as raw materials，palmitic acid as acyl donor，Lipozyme TL IM as enzyme reagent and hexane as solvent，soybean phospholipids with palmitic acid acidolysis was prepared using lipasecatalyzed.The optimal reaction conditions were obtained through experiment：phospholipids concentration（hexane/ phospholipids）5∶1，substrate ratio（palmitic acid/phospholipids）5∶1，lipase dosage（based on the total substrates）20%，reaction temperature 65℃，reaction time 60h，and water addition（based on lipase）2%.Incorporation of palmitic acid was up to 34.45%.

soybean phospholipids；palmitic acid；lipase；acidolysis

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0236-05

大豆磷脂是大豆油精煉時(shí)的副產(chǎn)品，我國大豆制油能力已達(dá)2400～2500萬t/年，磷脂資源十分豐富。大豆磷脂具有雙親性，是一種天然表面活性劑，有乳化、分散、起泡、脫膜、降低粘度、保持水分等各種功能，因此，研究大豆磷脂的性質(zhì)，拓寬它的應(yīng)用領(lǐng)域，具有重要的意義［1-3］。天然磷脂分子中含有較多的不飽和雙鍵，因而很不穩(wěn)定，在空氣中易氧化，使顏色變深且產(chǎn)生難聞氣味。因而，目前大豆磷脂產(chǎn)品存在色深、異味、不穩(wěn)定、易氧化等缺點(diǎn)，這些缺陷在很大程度上限制了它的應(yīng)用。為了使磷脂在應(yīng)用科學(xué)和技術(shù)上充分發(fā)揮潛力，需要對(duì)其進(jìn)行修飾［4-5］。目前主要采取的方法是對(duì)磷脂進(jìn)行氫化，使脂肪酸的部分不飽和鍵變飽和。氫化后的磷脂的穩(wěn)定性、親水性、乳化性、滲透性、潤濕性、分散性比天然磷脂優(yōu)異［6］。磷脂的氫化同油脂的氫化原理相同，都屬于加成反應(yīng)，但磷脂的氫化較大豆油氫化困難，同時(shí)氫化過程中會(huì)產(chǎn)生大量的反式脂肪酸，反式脂肪酸對(duì)人體有害，有增加冠心病的危險(xiǎn)性。磷脂改性的另一主要方法為酯交換，與化學(xué)法相比，酶法酯交換具有較大優(yōu)勢：反應(yīng)溫和，可在普通環(huán)境中進(jìn)行；產(chǎn)物單一，不需要進(jìn)行復(fù)雜的分離步驟；不會(huì)改變磷脂的天然構(gòu)型；利用酶專一性，可以提高或強(qiáng)化磷脂某一功能特性，使其獲得某種新的物理特性［7-8］。在磷脂的酯交換反應(yīng)中，與脂肪酸酯相比，游離脂肪酸為更有效的?；w?？衫弥久复呋柡椭舅崤c大豆磷脂進(jìn)行酸解反應(yīng)，提高磷脂的飽和度，同時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生反式脂肪酸。二棕櫚酰磷脂酰膽堿是肺部活性劑的重要組成部分，它能夠穩(wěn)定空氣和肺界面的張力，維持肺部正常的呼吸功能，治愈早產(chǎn)兒的呼吸窘迫癥，并且正延伸到用于臨床肺損傷綜合征患者的治療上［9-10］。因此，實(shí)驗(yàn)選擇棕櫚酸為?；w。

2010-07-08

班婷婷（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：油脂與植物蛋白工程。

江蘇省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新資金（BC2008021）。