基于COI條形碼序列的珍珠母及其混偽品的DNA分子鑒定△

杜鶴，崔麗娜，姚輝，宋經(jīng)元，張輝*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

資源

基于COI條形碼序列的珍珠母及其混偽品的DNA分子鑒定△

杜鶴1，崔麗娜1，姚輝2，宋經(jīng)元2，張輝1*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

目的：探討應(yīng)用COI條形碼序列對(duì)珍珠母及其混偽品進(jìn)行物種鑒定的可行性。方法：用MEGA 4.0等軟件計(jì)算珍珠母及其混偽品種內(nèi)及種間變異，構(gòu)建珍珠母及其混偽品的NJ樹。結(jié)果：珍珠母種內(nèi)COI序列變異小，種間存在較多的變異位點(diǎn)，種間的遺傳距離顯著大于種內(nèi)的遺傳距離。通過構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖可以看出，珍珠母不同來源個(gè)體均聚在一起，能夠與其混偽品區(qū)分開。結(jié)論：基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可以很好的鑒定珍珠母的正品來源及其混偽品。

珍珠母；DNA條形碼；COI；鑒定

珍珠母Margaritifera concha為我國(guó)常用中藥材，具有平肝潛陽，安神定驚，明目退翳的功效。用于頭痛眩暈，驚悸失眠，目赤翳障，視物昏花[1]。據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版記載，珍珠母為蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsis cumingii（Lea）、褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteria martensii（Dunker）的貝殼。去肉，洗凈，干燥?，F(xiàn)市場(chǎng)以其混偽品和同屬做珍珠母藥用的情況較為普遍，如蜆科動(dòng)物河蜆Corbicula fluminea（Muller）、蚌科動(dòng)物背瘤麗蚌Lamprotula leai（Gray）等[2]。由于珍珠母正品與其混偽品的形態(tài)學(xué)特征差別很細(xì)微，用傳統(tǒng)的方法很難鑒定，所以為保正藥材的質(zhì)量及其臨床療效，需要更快速、準(zhǔn)確地方法鑒定珍珠母的正品來源與其混偽品。

DNA條形碼技術(shù)是近來發(fā)展起來的物種鑒定新方法，通過對(duì)基因組中一段短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段進(jìn)行分析從而對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[3-4]，成為生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向[5-8]。本研究是應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)，對(duì)珍珠母及其混偽品的DNA條形碼COI序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，進(jìn)而對(duì)珍珠母及其混偽品進(jìn)行鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料

褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）藥材購自安徽亳州藥材市場(chǎng)，標(biāo)本號(hào)AS13MT01、AS13MT02。兩種混偽品COI序列來自于GenBank，珍珠母及其混偽品信息見表1。

表1 材料來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取新鮮材料，去殼后用已滅菌的手術(shù)剪把樣品剪成小塊，取30 mg樣品，用液氮研碎肌肉組織[9]，再用 DNA提取研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨 2 min（30次·min－1）后，使用動(dòng)物DNA提取試劑盒（北京天根生化公司）提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 擴(kuò)增引物COI序列通用引物：正向?yàn)?LCOI490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向?yàn)?HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[10]。PCR反應(yīng)體積為 25μL，體系內(nèi)含 MgCl22μL（25 mmol·L－1）、dNTP 2μL（2.5 mmol·L－1）、PCR buffer2.5μL（10×）、引物各1.0μL（2.5μmol·L－1）（北京生工生物技術(shù)公司合成）、聚合酶0.2μL（Biocolor BioScience＆Technology Co.，China）、雙蒸水13.3μL、總 DNA約1μL（～30 ng）。PCR反應(yīng)條件為：94℃，1min；94℃，1 min，45℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5cycles；94 ℃，1 min，50℃，1.5 min，72℃，1 min，35cycles；72℃，5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL測(cè)序儀（Applied Biosystems Co.，USA）雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V 2.06拼接并校正，去除引物區(qū)，獲得長(zhǎng)度為658bp的樣品序列。對(duì)于從GenBank獲得的COI序列，采用CodonCode Aligner V 2.06軟件，與拼接好的樣品序列比對(duì)后，去除與樣品序列相對(duì)應(yīng)的658 bp以外的區(qū)段，保留長(zhǎng)度≥550 bp的網(wǎng)上序列。最后將序列用軟件MEGA 4.0比對(duì)并進(jìn)行遺傳距離等分析，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，同時(shí)利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種內(nèi)序列變異

樣品AS13MT01與AS13MT02序列長(zhǎng)度為658 bp，含3個(gè)PolyT和1個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為39.6%。12個(gè)種內(nèi)序列，比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，有15個(gè)堿基變異位點(diǎn)，詳見表2。種內(nèi)平均K2P距離為0.005 4，種內(nèi)最大K2P距離為0.011 5。

表2 褶紋冠蚌種內(nèi)堿基變異情況表

2.2 種間序列變異

褶紋冠蚌與其主要混偽品COI序列間存在較多的變異位點(diǎn)（見圖1），種間平均K2P距離為0.356 3，最小K2P距離為0.193 4。

圖1 珍珠母及其混偽品序列間的變異位點(diǎn)

2.3 珍珠母及其混偽品NJ樹

基于COI序列，通過鄰接法（NJ）所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖2）可以看出，珍珠母不同來源個(gè)體均聚在一起，支持率為100，同時(shí)也很容易與其余混偽品區(qū)別開來。因此COI條形碼序列適用于藥材珍珠母與其混偽品的鑒定。

圖2 基于COI序列構(gòu)建的珍珠母及其混偽品的鄰接（NJ）樹

3 討論

珍珠母種內(nèi)COI序列有15個(gè)變異位點(diǎn)，種內(nèi)平均K2P變異為0.005 4，種內(nèi)最大K2P變異為0.011 5。說明珍珠母種內(nèi)COI序列變異很小比較穩(wěn)定。珍珠母及其混偽品COI序列種間K2P距離的平均值為0.356 3，最小 K2P距離為0.193 4。存在較多的變異位點(diǎn)，種間的遺傳距離顯著大于種內(nèi)的遺傳距離。同時(shí)，從基于COI序列構(gòu)建的珍珠母及其混偽品NJ樹可以看出，珍珠母不同來源個(gè)體均聚在一起，支持率較高，與其它混偽品能夠很明顯區(qū)分開。因此，基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可以很好的鑒定珍珠母及其混偽品，為該藥材的準(zhǔn)確鑒定提供了新的方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：216.

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Molecular Identification of Margaritifera concha and its Adulterants Using COIBarcode Sequence

DU He1，CUILi-na1，YAO Hui2，SONG Jing-yuan2，ZHANG Hui1
（1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun130117，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193，China）

Objective：This study explores the feasibility of using the COIbarcode sequence in identification of the Margaritifera concha and its adulterants.Methods：Intra-and inter-specific genetic distances ofMargaritifera concha and its adulterants have been analyzed by MEGA 4.0 software using COI sequences and the NJ tree has been constructed.Results：Margaritifera concha exhibited low intra-specific sequence variation and the inter-specific sequence have high variation between Margaritifera concha and its adulterants.The inter-specific genetic distanceswere obviously higher than the intra-specific ones.The sample of Margaritifera concha clustered together and can separated from its adulterants in the dendrogram constructed.Conclusion：As a DNA barcode，COI sequence can identify the Margaritifera concha with its adulterants.

Margaritifera concha；DNA barcoding；COI；identification

吉林省財(cái)政廳項(xiàng)目——藥用動(dòng)物DNA條形碼鑒定技術(shù)研究

*張輝，E-mail：zhanghui＿8080＠163.com

2011-10-08）