不同產(chǎn)地藏藥材濕生扁蕾中活性成分含量的研究△

景明，羅永皎，李碩，李成義

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

不同產(chǎn)地藏藥材濕生扁蕾中活性成分含量的研究△

景明*，羅永皎，李碩，李成義

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

目的：通過(guò)測(cè)定不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)期濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量，考察濕生扁蕾的最佳采收期與最佳產(chǎn)地。方法：用RP-HPLC法，樣品直接用70%乙醇提取進(jìn)樣，ZORBAXSB-C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，柱溫30℃，甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫，流速1mL·min－1。分析了甘肅15個(gè)不同產(chǎn)地濕生扁蕾藥材中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量。結(jié)果：15個(gè)不同產(chǎn)地濕生扁蕾藥材中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量差別較大，其中木犀草素最高為1.79 mg·g－1，最低為0.24 mg·g－1，1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮最高為0.68 mg·g－1，最低為0.13 mg·g－1。結(jié)論：同一產(chǎn)地以8月份采收的濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量最高；甘肅15個(gè)產(chǎn)地中以臨潭縣下拉地村產(chǎn)濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量最高。

濕生扁蕾；含量測(cè)定；反相高效液相色譜

濕生扁蕾為龍膽科扁蕾屬植物Gentianopsis paludosa（Munro）Ma.的干燥全草，藏藥稱(chēng)機(jī)合斗，產(chǎn)于甘肅、青海、四川、西藏等地區(qū)，生長(zhǎng)在海拔2300～4100 m的河灘草地、溝邊、山坡。具有清熱解毒、健脾止瀉等功能，藏醫(yī)用全草治療肝炎、膽囊炎、熱病發(fā)斑、目赤腫痛、消化不良、腸胃炎等［1］。所含的化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、酮類(lèi)、三萜類(lèi)、三十烷醇、胡蘿卜苷及β-谷甾醇，還含有酚類(lèi)、有機(jī)酸等［2-3］，其中酮類(lèi)、黃酮類(lèi)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗腹瀉作用［4-5］。《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥分冊(cè)》中收載了濕生扁蕾藥材，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未制定含量測(cè)定指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)擬采用RP-HPLC測(cè)定藏藥濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量，對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量作一比較，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent HP1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；ZORBAXSB-C18色譜柱 （美國(guó)安捷倫）；AE-240電子天平（梅特勒－托利多儀器上海分公司）；KQ-100超聲波清洗器（昆山市超聲技術(shù)有限公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布奇）。甲醇（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；磷酸（分析純，白銀良友化學(xué)試劑有限公司）；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

木犀草素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111520-200201），1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品（自提，HPLC歸一化法測(cè)定純度達(dá)98%以上）。濕生扁蕾藥材采自甘肅15個(gè)不同產(chǎn)區(qū)，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)所中藥室宋平順主任中藥師鑒定為濕生扁蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流速：1mL·min－1；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～15min，A∶B＝35∶65，15～60min，A∶B＝60∶40）；記錄時(shí)間為60min。理論塔板數(shù)均大于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取木犀草素對(duì)照品5.4 mg、1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品4.3 mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1mL，用甲醇定容至5mL量瓶中，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取不同產(chǎn)地、不同采收期濕生扁蕾藥材的干燥粉末（60目）1.0 g，置于50mL量瓶中，加入70%乙醇40mL，超聲處理20min，放冷，用70%乙醇定容至50mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液2，4，8，10，12，16，18，20μL，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的回歸方程分別為：Y＝84.526X－49.163（r＝0.9994），Y＝112.431X－117.129（r＝0.9991）。結(jié)果木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮分別在0.216～2.16μg和0.172～1.72μg線(xiàn)性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的RSD分別為1.03%和0.97%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12 h各進(jìn)樣 10μL，木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的RSD分別為1.09%和1.21%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批濕生扁蕾藥材1.0 g，共5份，分別按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，各取10μL進(jìn)樣測(cè)定，木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的RSD分別為1.71%和1.36%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的濕生扁蕾藥材（木犀草素含量：1.79 mg·g－1，1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮含量：0.68 mg·g－1）0.5 g，共5份，每份精密加入一定量的木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地（甘肅臨潭縣下拉地村）不同采收期濕生扁蕾藥材樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別精密吸取10μL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2、表3及圖1、圖2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

表2 不同產(chǎn)地濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù) ／mg·g－1

表2 不同產(chǎn)地濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù) ／mg·g－1

產(chǎn)地 采收日期／年-月-日 木犀草素 1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮2008-07-22 1.48 0.57甘肅臨潭縣下拉地村 2008-07-22 1.79 0.68甘肅卓尼縣上卓村 2008-07-22 0.93 0.33甘肅卓尼縣口子下村 2008-07-22 1.15 0.41甘肅卓尼縣剎地溝村 2008-07-22 1.54 0.69甘肅臨潭縣江果河村 2008-07-23 1.21 0.46甘肅合作市多合寺村 2008-07-23 0.91 0.37甘肅合作市德烏魯村 2008-07-25 1.10 0.42甘肅合作市上上加寺村 2008-07-25 0.77 0.29甘肅合作市日多馬村 2008-07-25 1.33 0.51甘肅碌曲縣科才溝口村 2008-07-27 1.24 0.46甘肅碌曲縣唐龍多村 2008-07-27 0.96 0.35甘肅夏河縣洛赤霍納尕村 2008-07-28 0.78 0.27甘肅夏河縣觀音大莊村 2008-07-28 1.11 0.44甘肅夏河縣甘加貢瑪村甘肅臨潭縣冶力關(guān)村2008-07-28 0.24 0.13

表3 不同采收期濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)／mg·g－1

表3 不同采收期濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)／mg·g－1

采收日期／年-月-日 木犀草素 1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮2009-07-14 1.03 0.392009-07-20 1.26 0.472009-07-28 1.59 0.622009-08-07 1.64 0.652009-08-15 1.66 0.642009-08-24 1.53 0.602009-09-03 1.42 0.572009-09-15 1.40 0.522009-09-22 1.38 0.472009-10-04 1.33 0.442009-11-09 1.35 0.412009-12-07 1.30 0.39

圖1 木犀草素及1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮對(duì)照品HPLC圖

圖2 濕生扁蕾樣品HPLC圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)曾考察了乙腈－水、甲醇－水、甲醇－0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果以甲醇－0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相線(xiàn)性梯度洗脫，木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮峰可以達(dá)到基線(xiàn)分離，峰形對(duì)稱(chēng)，分離度好。同時(shí)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇，通過(guò)比較254，260，270，280nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm時(shí)，色譜峰最高。

實(shí)驗(yàn)中還曾對(duì)超聲與熱回流進(jìn)行比較，結(jié)果兩種提取方法提取物的含量相當(dāng)。同時(shí)對(duì)提取溶劑甲醇、70%甲醇水溶液、無(wú)水乙醇、70%乙醇水溶液進(jìn)行考察，結(jié)果以70%乙醇提取物的含量最高。對(duì)超聲提取時(shí)間10，20，30，40min的考察表明，70%乙醇超聲20min提取基本完全，故采用70%乙醇超聲提取20min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘肅15個(gè)不同產(chǎn)地濕生扁蕾全草中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量差別較大，其中木犀草素最高為1.79 mg·g－1（甘肅臨潭縣下拉地村），最低為0.24 mg·g－1（甘肅夏河縣甘加貢瑪村），1，7-二羥基-3，8-二甲氧基口山酮最高為0.68 mg·g－1（甘肅臨潭縣下拉地村），最低為0.13 mg·g－1（甘肅夏河縣甘加貢瑪村）；而且同為甘南地區(qū)不同縣村之間也有較大差異。分析影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素可能是生態(tài)環(huán)境（光照、氣候、土壤等）和采收期的不同所致。

本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以作為控制濕生扁蕾藥材質(zhì)量的方法之一；不同產(chǎn)地的濕生扁蕾中木犀草素和1，7-二羥基-3，8-二甲氧基酮的含量差別較大，有必要進(jìn)行最佳產(chǎn)地的優(yōu)選和不同采收期的含量比較研究。

［1］張寶琛，甄潤(rùn)德，胡柏林，等.濕生扁蕾的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，1980，11（4）：149.

［2］李作平，霍長(zhǎng)虹，鄭小莉.扁蕾的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2003，20（1）：24.

［3］王煥弟，譚成玉，杜昱光，等.藏藥濕生扁蕾的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（14）：1059.

［4］王煥弟，譚成玉，白雪芳，等.藏藥濕生扁蕾有效成分抑菌作用初探［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2005，17（5）：598-599.

［5］米琴，曹長(zhǎng)年，趙宙光，等.藏藥濕生扁蕾有效成分的研究［J］.青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，23（2）：64.

Research of Active Ingredient Content in Gentianopsis Paludosa From Different Places

JING ming，LUO Yong-jiao，LIShuo，LI Cheng-yi
（Gansu college of TCM，Lanzhou 730000，China）

Objective：To identify the optimal harvest time and area of Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma，the contents of luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone of Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma from different areas and different harvest phases were determined.MethodsRP-HPLC method was used ZORBAXSB-C18column was applied.The detection wavelength was set at260nm.The column temperature at 30℃.Themobile phase consisted of methonal-0.4%phosphoric acid solution in a gradient elution mode at 1mL·min－1。The content of luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone of Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma from 15 different areas of Gansu were analysed.Results：The contents of luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone of Gentianopsispaludosa（Mum.）Ma from 15 different areaswere significantly different.Luteolin，the highestwas 1.79 mg·g－1and the lowestwas0.24 mg·g－1.1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone，the highestwas0.68mg·g－1and the lowestwas0.13mg·g－1.Conclusion：From the same place，the luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone of Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma gathered at August have the highest content.15 different areas of Gansu，the luteolin and 1，7-dihydroxy-3，8-dimethoxyxanthone of Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma from Xialadi village in Lintan county were the highest.

Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma；Content determination；RP-HPLC

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（0804NKCA119-08）；甘肅省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（07-CZK-50）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008-1-172）

*景明，Tel：（0931）8765459，E-mail：jm＠gszy.edu.cn

2010-11-22）