兩種黔產(chǎn)淫羊藿總黃酮對(duì)爪鼠學(xué)習(xí)記憶的對(duì)比研究△

鄭民強(qiáng)，鄧煒，黃聰，張靜

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550002）

藥理研究

兩種黔產(chǎn)淫羊藿總黃酮對(duì)爪鼠學(xué)習(xí)記憶的對(duì)比研究△

鄭民強(qiáng)，鄧煒*，黃聰，張靜

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的：研究貴州地方品種粗毛淫羊藿與黔嶺淫羊藿中淫羊藿總黃酮（TFE）對(duì)化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響，比較兩種黔產(chǎn)淫羊藿TFE對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶改善效果差異。方法：實(shí)驗(yàn)選用東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學(xué)藥品分別復(fù)制出學(xué)習(xí)記憶損傷模型，按劑量1300，650 mg·kg－1灌胃TFE 14 d，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索能力為指標(biāo)進(jìn)行其行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：兩種TFE均能改善東莨菪堿等3種化學(xué)藥物致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且呈量效依賴(lài)關(guān)系。粗毛淫羊藿比黔嶺淫羊藿改善記憶能力效果更好一些。結(jié)論：兩種黔產(chǎn)淫羊藿TFE可明顯改善東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學(xué)藥物所致的空間記憶障礙，其效果與腦復(fù)康效果接近。兩種TFE作用差異明顯，粗毛淫羊藿優(yōu)于黔嶺淫羊藿。提示ICA是TFE中增強(qiáng)記憶的主要物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)也提示除了ICA外，TFE中尚有其他改善學(xué)習(xí)記憶的有效成分。

黔嶺淫羊藿；粗毛淫羊藿；淫羊藿總黃酮，學(xué)習(xí)記憶；比較研究

黔產(chǎn)粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種，為淫羊藿常用中藥及民族藥品種。據(jù)調(diào)查，目前以淫羊藿為主要生產(chǎn)原料的貴州多家藥廠及飲片配方仍以粗毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿等為主要來(lái)源。淫羊藿總黃酮（TFE）是淫羊藿主要藥效成分，而淫羊藿苷（ICA）則是淫羊藿總黃酮中的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。據(jù)研究報(bào)道貴州產(chǎn)多種淫羊藿其TFE、ICA含量均能達(dá)到或超過(guò)《中國(guó)藥典》1995年版標(biāo)準(zhǔn)，但黔嶺淫羊藿地上部分中ICA含量卻很低，小于0.1%［1］，其藥理作用與同屬植物其他藥用種是否存在差異，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。學(xué)習(xí)記憶能力減退是衰老和老年癡呆的共同臨床表現(xiàn)，多種化學(xué)藥品可致記憶缺失，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)TFE、ICA有益智，增強(qiáng)記憶作用［2，3］。本研究分別提取粗毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿總黃酮物質(zhì)，對(duì)東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺致學(xué)習(xí)記憶損傷模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，比較兩種藥物對(duì)不同學(xué)習(xí)記憶障礙模型的改善作用之差異，以評(píng)價(jià)其藥用價(jià)值。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種健康小鼠，清潔級(jí)，體重（22±2）g，雌雄兼用，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黔）2002-001。在實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)3 d后，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 藥品

藥材樣品分別采自貴州貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)，貴州惠水縣，經(jīng)過(guò)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志教授準(zhǔn)確鑒定為粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn。兩種淫羊藿TFE提?。焊魅「稍镆蜣角o葉1kg，照文獻(xiàn)方法提?。?］，分別得總黃酮提取物32.28，27.44 g，得率為3.23%，2.74%；經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定其TFE含量以ICA計(jì)分別為58.4%，31.4%。分別用生理鹽水制備成130，65 mg·mL－12個(gè)濃度為實(shí)驗(yàn)用藥。

氫溴酸東莨菪堿（Scopolamine，Sco）注射液（廣州明興制藥廠，批號(hào)：20070202）；環(huán)磷酰胺注射劑（Cyclophosphammide，Cy）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20081205）；戊巴比妥鈉（pentobarbital，ptb）（分析純）［中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：F20021216］；腦復(fù)康片（piracetam tablet，廣州華南制藥廠，批號(hào)：20080403）。

1.3 儀器

Morris水迷宮系統(tǒng)（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；DT-200電子天平（美國(guó)雙杰集團(tuán)常熟雙杰測(cè)試儀器廠）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練、篩選及實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前須先對(duì)小鼠進(jìn)行 Morris水迷宮訓(xùn)練。Morris水迷宮為一不銹鋼圓柱形水池（120cm×50cm）和一可移動(dòng)位置的圓柱形平臺(tái)（10cm×24cm）組成。實(shí)驗(yàn)水深25cm（沒(méi)過(guò)平臺(tái)1cm），水溫（23±2）℃，水中加入白乳化劑以遮隱平臺(tái)。水池正上方攝像頭與計(jì)算機(jī)連接，實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物活動(dòng)全程跟蹤，可記錄動(dòng)物游泳軌跡、定位航行、逃避潛伏期、空間探索能力、航行距離以及游泳速度等指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索能力2項(xiàng)指標(biāo)為小鼠學(xué)習(xí)記憶能力判定指標(biāo)。定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練：將水池分成4個(gè)象限，在第一象限正中放置平臺(tái)。分別將小鼠從第三象限面壁逐一放入水中，觀察記錄小鼠2min內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期。2min內(nèi)找到平臺(tái)為合格動(dòng)物，讓動(dòng)物于平臺(tái)上停留10 s后取出。如果在2min內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)上，并停留10 s取出，再進(jìn)行下一只?？臻g探索能力訓(xùn)練：移去平臺(tái)，將小鼠從對(duì)側(cè)象限面壁放入池中，記錄小鼠2min內(nèi)穿越平臺(tái)位置的次數(shù)。將訓(xùn)練小鼠無(wú)明顯智能差異者為合格留用，不合格者淘汰。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)試2次·d－1×3 d；空間探索能力測(cè)試 2次·d－1×2 d。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

正式實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別取訓(xùn)練合格小鼠70只，隨機(jī)分7組，為空白對(duì)照組，化學(xué)藥物致記憶損傷模型組，腦復(fù)康陽(yáng)性對(duì)照組500 mg·kg－1，粗毛TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）劑量組，黔嶺TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）劑量組。除空白對(duì)照組及模型組給予等容積0.9%氯化鈉溶液，各組均按劑量灌胃給藥14 d。

2.2.1 兩種TFE對(duì)小鼠東莨菪堿（Sco）所致的獲得性記憶障礙的改善作用 于給藥第9天起每天對(duì)各組小鼠（空白組除外）給予 Sco 2 mg·kg－1，ip，25min后，進(jìn)行小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)定位航行和空間探索能力，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 兩種TFE對(duì)小鼠戊巴比妥（ptb）所致的方向辨別障礙的保護(hù)作用 于給藥第9天起每天對(duì)各組小鼠（空白組除外）給予 ptb 15 mg·kg－1，ip，25min后，進(jìn)行小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)定位航行和空間探索能力，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.3 兩種TFE對(duì)環(huán)磷酰胺（Cy）誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙的影響 于給藥第9天對(duì)各組小鼠（空白組除外）給予 Cy 80 mg·kg－1，ip，造成學(xué)習(xí)記憶障礙的動(dòng)物模型，1 h后，采用水迷宮法檢測(cè)小鼠定位航行和空間探索能力，連續(xù)5 d，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 兩種TFE對(duì)Sco小鼠獲得性記憶障礙的改善作用

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種TFE對(duì)Sco小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（±s）

表1 兩種TFE對(duì)Sco小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（±s）

注：（1）n＝10；（2）與對(duì)照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺(tái)次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.95 8.83±2.25 Sco模型組 2 91.62±22.74▲▲ 93.61±28.47▲▲ 96.72±27.12▲▲ 4.49±1.34▲▲ 3.67±0.89▲▲腦復(fù)康＋Sco 500＋2 68.38±10.51** 63.55±18.96** 65.42±22.53** 6.68±2.06** 5.00±2.00*粗毛TFE高＋Sco 1300＋2 53.59±21.98** 57.60±25.37** 68.42±22.11** 6.26±1.64** 5.25±2.22**粗毛TFE低＋Sco 650＋2 67.16±23.29** 66.97±22.39** 76.86±16.26* 5.60±1.57* 5.75±2.41**黔嶺TFE高＋Sco 1300＋2 69.05±19.89** 78.57±25.47* 66.17±15.35** 6.70±1.27** 5.30±1.81**黔嶺TFE低＋Sco 650＋2 74.12±11.84* 78.38±1.92* 74.03±29.25* 5.39±1.73* 5.80±1.66空白對(duì)照組 42.15±19.90 43.84±24.44 53.32±19.30 9.94±2**

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.01），說(shuō)明東莨菪堿可造成小鼠空間記憶障礙。與模型組比較，兩種TFE高、低劑量組小鼠水迷宮游泳逃避潛伏期均顯著減少，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，與腦復(fù)康組沒(méi)有顯著差別；兩種TFE高劑量組療效較好，說(shuō)明有量效依賴(lài)性；粗毛淫羊藿顯示出更為明顯的效應(yīng)。提示2種黔產(chǎn)TFE均可對(duì)抗2 mg·kg－1東莨菪堿所造成的小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得障礙，能提高定位航行和空間探索能力，對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙具有明顯的改善作用。

3.2 兩種TFE對(duì)ptb小鼠方向辨別障礙的保護(hù)作用

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩種TFE對(duì)ptb小鼠方向辨別障礙的保護(hù)作用±s）

表2 兩種TFE對(duì)ptb小鼠方向辨別障礙的保護(hù)作用±s）

注：（1）n＝10；（2）與對(duì)照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺(tái)次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天13 7.12±1.10 ptb模型組 15 102.24±21.13▲▲ 97.24±21.46▲▲ 96.23±18.14▲▲ 3.14±1.19▲▲ 3.18±1.13▲▲腦復(fù)康＋ptb 500＋15 61.46±21.27**66.84±15.43** 68.90±11.49** 5.19±1.13** 5.18±1.16**粗毛TFE高＋ptb 1300＋15 59.38±21.18**61.27±14.27** 66.87±17.13** 5.17±1.53** 5.24±1.71**粗毛TFE低＋ptb 650＋15 69.51±31.05**75.23±21.51* 78.19±12.19* 4.81±1.14** 5.13±1.62**黔嶺TFE高＋ptb 1300＋15 64.31±24.22**77.42±29.68* 65.33±10.21** 4.73±2.44* 5.01±2.87*黔嶺TFE低＋ptb 650＋15 73.24±15.07**76.54±27.30* 76.52±20.03* 4.24±1.76* 4.17±1.53空白對(duì)照組 46.89±31.0 51.81±17.22 55.16±11.70 8.17±1.*

巴比妥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有顯著的抑制作用，可導(dǎo)致方向辨別障礙。表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，ptb模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.01），提示小鼠記憶障礙模型形成。連續(xù)給藥14 d后，與模型組比較兩種TFE高、低劑量組小鼠游泳逃避潛伏期均顯著減少，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，與陽(yáng)性藥組差異不明顯；兩種TFE高劑量組療效較好，呈明顯量效依賴(lài)。表明TFE可明顯提高ptb小鼠正確辨別方向的能力，對(duì)ptb小鼠所致的方向辨別障礙有一定的改善和保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)粗毛淫羊藿療效優(yōu)于黔嶺淫羊藿。

3.3 兩種TFE對(duì)Cy小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)［5］報(bào)道一致，Cy可使小鼠學(xué)習(xí)記憶缺失，與正常對(duì)照組比較，Cy模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.01），提示小鼠記憶障礙形成。TFE的促智作用已有報(bào)道［2］，但探討TFE對(duì)Cy誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶缺失的影響未見(jiàn)報(bào)道。表3研究結(jié)果表明，與Cy組比較，TFE可使Cy小鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，尤以粗毛淫羊藿作用顯著（P＜0.01），與腦復(fù)康組沒(méi)有明顯差別，提示兩種TFE都能提高Cy小鼠定位航行和空間探索能力，對(duì)Cy小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，以粗毛淫羊藿效果為好。

表3 兩種TFE對(duì)Cy小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（±s）

表3 兩種TFE對(duì)Cy小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（±s）

注：（1）n＝10；（2）與對(duì)照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺(tái)次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.08 8.16±1.11 Cy模型組 80 102.47±29.35▲▲ 93.63±16.63▲▲ 103.11±26.02▲▲ 4.26±2.07▲▲ 4.73±1.24▲▲腦復(fù)康＋Cy 500＋80 70.35±17.11**61.42±14.28** 78.91±27.03**7.29±2.53** 6.71±1.36**粗毛TFE高＋Cy 1300＋80 68.14±40.44**56.64±23.37** 76.33±24.17**6.58±1.76** 6.25±1.52**粗毛TFE低＋Cy 650＋80 74.13±43.21* 69.37±18.09** 68.33±22.16**5.51±1.42* 5.79±1.10*黔嶺TFE高＋Cy 1300＋80 64.25±44.06**59.43±17.12** 67.11±20.29**7.36±2.75** 5.74±1.27*黔嶺TFE低＋Cy 650＋80 83.52±15.78* 75.87±15.14* 72.35±13.43**空白對(duì)照組 64.16±10.18 42.70±18.45 59.78±27.93 8.44±24.99±3.08 4.78±1.61

4 討論

改善學(xué)習(xí)、增強(qiáng)記憶功能是評(píng)價(jià)藥物抗癡呆有效性的重要指標(biāo)［6］，據(jù)研究，改善動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力的藥物對(duì)治療人類(lèi)癡呆癥同樣有效?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿在骨質(zhì)代謝、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等具有多方面的顯著生物學(xué)活性，TFE是這些功能的有效成分，而ICA則是TFE中主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［7］。黔嶺淫羊藿地上部分因ICA含量極少，不主張作為藥用品［1］，但缺乏相關(guān)的藥效依據(jù)支撐。本研究以小鼠空間記憶能力為指標(biāo)，比較研究?jī)煞N黔產(chǎn)淫羊藿TFE對(duì)改善小鼠認(rèn)知功能的作用，結(jié)果證明兩者均有較好的作用。

人的記憶思維與中樞膽堿能神經(jīng)功能密切相關(guān)，海馬及其環(huán)路功能遭受破壞，會(huì)發(fā)生近期記憶障礙［6］。東莨菪堿作為中樞膽堿能受體拮抗劑，可降低大腦皮質(zhì)和海馬膽堿能系統(tǒng)活性，對(duì)記憶獲得產(chǎn)生阻抑效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用測(cè)試前給藥觀察到兩種TFE可對(duì)抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙，提示可能與膽堿能神經(jīng)功能改善有關(guān)。但目前的研究還缺乏證據(jù)證明TFE如何改善膽堿能神經(jīng)，是否提高乙酰膽堿的含量和膽堿受體功能。巴比妥通過(guò)影響中樞GABA能神經(jīng)功能，產(chǎn)生中樞抑制作用，可導(dǎo)致方向辨別障礙。研究揭示［7］齒狀回GABA能神經(jīng)減少越明顯，老年學(xué)習(xí)記憶損害越嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明TFE對(duì)戊巴比妥鈉引起的小鼠方向辨別障礙有一定的保護(hù)作用，與模型組比較具有明顯的差異，以高劑量組作用較強(qiáng)；粗毛淫羊藿顯示出更為明顯的差異。這是否是通過(guò)增加齒狀回GABA能神經(jīng)來(lái)改善記憶障礙，有待深入研究。環(huán)磷酰胺通過(guò)與DNA交叉聯(lián)結(jié)，干擾RNA轉(zhuǎn)錄而抑制蛋白質(zhì)合成，環(huán)磷酰胺能導(dǎo)致記憶缺失，可能與腦內(nèi)新蛋白質(zhì)的合成減少密切相關(guān)［8］。兩種TFE對(duì)環(huán)磷酰胺所造成的記憶鞏固缺陷有改善作用，是否與TFE促進(jìn)蛋白質(zhì)合成作用有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

兩種淫羊藿總黃酮均可對(duì)抗東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學(xué)藥物所致的記憶障礙，明顯改善記憶功能，且呈量效依賴(lài)性，提示本品具有易化記憶、提高智力和減緩智力衰退作用。從3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，粗毛淫羊藿TFE改善記憶作用明顯優(yōu)于黔嶺淫羊藿TFE，提示ICA可能是TFE中主要增強(qiáng)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)也提示TFE中除了ICA外，尚有其他改善學(xué)習(xí)記憶的有效成分。

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Comparative Study on TFE of Two Species of Epimedium in Guizhou on the Learning Memory Disorder

ZHENG min-qiang，DENG Wei，HUANG Cong，ZHANG Jing
（Dept.of Pharmacology Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China）

Objective：Study on the effect of TFE in Epimedium acuminatum and E.leptorrhizum in Guizhou to learning-memory impairment model mice induced by scopolamine chemical substances etc.Methods：To set up memory disorder mice by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide were injecting intraperitoneal and by TFE of two species of 1300，650 mg·kg－1×14 d from the mice ig.The Morris Water Maze was used to check directional navigation experiments and space exploration experiments.Results：The two species of TFE have an obvious improved for three different memory disorder mice induced by scopolamine etc.and both of the 2 species of TFE showed concentration-response dependence.Among them，The effect of improve the learning and memorizing ability inmice，the TFE of E.acuminatum is better.Conclusion：Both the TFE the 2 species of Epimedium in Guizhou could obviously improved of space learingmemory disorder by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide.Their effect is similar with the Piracetam Tablets.E.acuminatum superior to E.leptorrhizum and there is great difference between them.The results suggest that the ICA is the main substance improve memory.Also hints，may be there′s another bioactive components of improvememory except the ICA in TFE.

Epimedium leptorrhizum；E.acuminatum；TFE；Learning and memory；Comparative study

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目（2008-01-15）

*鄧煒，E-mail：dengwei0517＠yahoo.cn

2010-08-27）