不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量測定△

劉曉芳，劉養(yǎng)清，韓雪，焦建華，陳元元

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024）

質(zhì)量

不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量測定
△

劉曉芳，劉養(yǎng)清*，韓雪，焦建華，陳元元

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024）

目的：建立大棗中多糖的提取和含量測定方法。方法：采用苯酚-硫酸顯色-分光光度法測定不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量，對(duì)不同的提取方法和影響顯色反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了考察。結(jié)果：測定了不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量，其差異很大。結(jié)論：該方法測定多糖含量具有操作簡單、精密度高、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于大棗的質(zhì)量控制。

大棗；多糖；分光光度法；苯酚-硫酸顯色法；質(zhì)量控制

大棗為鼠李科植物棗ZizyphusjujubaMill.的干燥成熟果實(shí)[1]，具有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神的功能[1]。大棗營養(yǎng)豐富，既可食用又可入藥，富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2-3]。研究表明，大棗多糖是大棗中具有重要生物功能的有效成分，營養(yǎng)保健價(jià)值很高[4-6]。建立大棗中多糖含量的測定方法，不僅可作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的參考，還能更好地進(jìn)行質(zhì)量控制。作者通過大量實(shí)驗(yàn)確定了大棗中多糖的提取方法，并采用苯酚-硫酸顯色法[7]測定了不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VIS-723G型可見光分光光度計(jì)；HC-2518型離心機(jī)；KQ5200V型超聲波清洗器。

1.2 試藥

葡萄糖對(duì)照品[8]，105℃干燥恒重，其他試劑均為分析純。乙醇溶液（80%）：20 mL蒸餾水中加入無水乙醇80 mL，混勻。氫氧化鈉溶液（100 g·L－1）：稱取100 g氫氧化鈉，加蒸餾水溶解并稀釋至1 L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。銅儲(chǔ)備液：取0.3 g硫酸銅 （含5個(gè)結(jié)晶水），3 g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻。銅試劑溶液：精密吸取銅儲(chǔ)備液50 mL，精密加入蒸餾水50 mL，混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5 g并使其溶解，臨用時(shí)新配。洗滌劑：移取蒸餾水50 mL，加入10 mL氫氧化鈉溶液，混勻。硫酸溶液（10%）：取100 mL濃硫酸加入到800 mL蒸餾水中，混勻，冷卻后稀釋至1 L。苯酚溶液（50 g·L－1）：取苯酚100 g，蒸餾，收集180～182℃餾分。稱取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻，溶液置冰箱中可保存1個(gè)月。

大棗樣品共收集了8種，分別為忻州大棗、呂梁玉喜大棗、呂梁灘棗、呂梁臨縣大棗、呂梁小棗、柳林大棗、保德貢棗、永和大棗。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品0.500 4 g，加水溶解，并定容至50 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液每1 mL含10.0 mg葡萄糖。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液每1 mL含葡萄糖0.1 mg。

2.1.2 加熱時(shí)間的確定 精密移取5份配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6mL和5份蒸餾水1.4 mL，分別混合，各加入配好的苯酚溶液1 mL，混勻，再各加濃硫酸10 mL，搖勻后靜置5 min，然后置沸水中分別加熱2，5，8，10，15 min，取出后放置10 min，根據(jù)掃描的吸收曲線，選擇在490 nm測定吸光度，分別為0.197，0.305，0.213，0.247，0.196，結(jié)果表明當(dāng)加熱5 min時(shí)吸光度最大，故確定加熱時(shí)間為5 min。

2.1.3 濃硫酸用量的確定 精密移取3份配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6 mL和3份蒸餾水1.4mL，分別混合，各加入配好的苯酚溶液1 mL，混勻，分別加濃硫酸5，8，10 mL，搖勻后靜置5 min，然后置沸水浴中加熱5 min，取出后放置10 min，根據(jù)掃描的吸收曲線，選擇在490 nm測定吸光度，分別為0.309，0.387，0.306，結(jié)果表明當(dāng)加入濃硫酸8 mL時(shí)吸光度值最大，故確定濃硫酸用量為8 mL。

2.1.4 最大吸收波長的確定 精密吸取配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6 mL和蒸餾水1.4 mL，混合，加入配好的苯酚溶液1 mL，混勻，精密加入濃硫酸8 mL，充分混勻后靜置5 min，然后置沸水中加熱5 min，取出后放置10 min，用分光光度計(jì)在400～650 nm波長處以試劑空白溶液為參比，1 cm玻璃比色皿測定吸光度值。根據(jù)掃描的光吸收曲線顯示其最大吸收波長為488.5 nm。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 樣品的提取 稱取大棗樣品1.5 g，加溶劑（蒸餾水）10 mL，微波加熱50 s，過濾后將樣品提取液定容至10 mL，供沉淀粗多糖。

2.2.2 沉淀粗多糖 精密吸取樣品提取液1.5 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇6 mL，混勻后，以3 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)?0%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄上清液，反復(fù)3～4次操作，殘?jiān)谜麴s水溶解并定容至5.0 mL，混勻后，供沉淀葡萄糖。

2.2.3 沉淀葡聚糖 精密吸取上述溶液2 mL置于20 mL離心管中，加入100 g·L－1氫氧化鈉 2.0 mL，銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻后以3 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)3次操作后，殘?jiān)?0%硫酸溶液2.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使 用 液：0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL（相當(dāng)于葡萄糖 0，0.010，0.020，0.040，0.060，0.080，0.100，0.120 mg）分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，加入50 g·L－1苯酚溶液1.0 mL，混勻后，小心加入濃硫酸8 mL，混勻后，置沸水浴中煮沸5 min，放置10 min后用分光光度計(jì)在488.5 nm波長處，以試劑空白為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y＝5.143 4X－0.001 5，r＝0.999 2，葡萄糖在0.010～0.120 mg線性關(guān)系良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)下方法，制備6份呂梁小棗的樣品溶液，測定吸光度，計(jì)算RSD＝2.62%。結(jié)果表明測定方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 連續(xù)5次測定柳林大棗樣品的吸光度，計(jì)算RSD＝0.26%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在10，20，30，60，90，120 min測定柳林大棗樣品的吸光度，計(jì)算RSD＝0.67%，結(jié)果表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的臨縣大棗約1.5g，精密稱定6份，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 （10 mg·mL－1）1mL，按2.2項(xiàng)下方法操作，分別測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 葡萄糖加樣回收率試驗(yàn)

2.4 不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量測定

精密吸取不同產(chǎn)地大棗樣品測定液2.0 mL置于25 mL比色皿中，加入50 g·L－1苯酚溶液 1.0 mL，混勻后，小心加入濃硫酸8 mL混勻，置沸水浴中煮沸5 min，放置10 min后用分光光度計(jì)在488.5 nm波長處，以試劑空白為參比，用1 cm比色皿測定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)葡萄糖的濃度，而后計(jì)算出多糖含量。多糖含量結(jié)果計(jì)算公式為：

式中：W1—樣品測定液中葡聚糖的質(zhì)量（g）

W2—樣品空白液中葡聚糖的質(zhì)量（g）

V1—粗多糖溶液體積（mL）

V2—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積（mL）

V3—樣品測定液總體積（mL）

V4—測定用樣品測定溶液體積（mL）

V—樣品提取液總體積（mL）

M—樣品量（mL）

m—樣品的質(zhì)量（g）

不同產(chǎn)地大棗中的多糖含量測定結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地大棗中的多糖含量

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

通過實(shí)驗(yàn)分別比較了超聲提取和微波提取兩種方法。超聲提取分別考察了超聲時(shí)間和次數(shù)，選擇超聲10，20，30，40 min，結(jié)果超聲 20 min時(shí)，吸光度最大；分別超聲1、2、3次，每次20 min，結(jié)果表明超聲兩次后基本能把多糖提取完全。微波提取考察了提取時(shí)間，分別加熱 10，20，30，40，50，60 s，結(jié)果表明微波加熱50 s時(shí)吸光度最大。通過超聲提取及微波提取多糖的結(jié)果比較，樣品的提取選擇微波加熱，加熱時(shí)間為50 s。

3.2 不同樣品多糖含量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，忻州大棗的多糖含量最高，為1.37%；呂梁臨縣大棗的多糖含量最低，為0.66%；表明不同產(chǎn)地的大棗中多糖含量差異較大。

上述實(shí)驗(yàn)確定的大棗中多糖的提取方法及苯酚-硫酸法測定大棗中多糖含量的方法操作簡單、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于大棗中多糖含量的測定和大棗的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：21-22.

[2]曲澤洲，王永蕙.中國棗樹志·棗卷[M].北京：中國林業(yè)出版社，1993：113-118.

[3]李進(jìn)偉，丁霄霖.金絲小棗多糖的提取及脫色研究[J].食品科學(xué)，2005，27（4）：150-154.

[4]林勤保，高大維.大棗多糖的分離和純化[J].食品工業(yè)科技，1998，（4）：20-21.

[5]張慶，林生，林勤保，等.大棗多糖體外抗補(bǔ)體活性促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用[J].中藥藥理與臨床，1998，15（5）：19.

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[7]胡居吾，范青生，肖小年.粗多糖測定方法的研究[J].江西食品工業(yè)，2005，（1）：16-18.

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Determination of Polysaccharide in Ziziphus jujube Mill.from Different Places

LIU Xiao-fang，LIU Yang-qing，HAN Xue，JIAO Jian-hua，CHEN Yuan-yuan
（ShanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，China）

Objective：To establiash the method for the extraction and determination of the content of polysaccharide inZiziphusjujubeMill..Methods：Phenol-sulfueic acid method and spectrophotometry were used to determine the content of polysaccharide inZiziphus jujubeMill..The different extracting methods and the main factors effecing color reaction were investigated.Results：The contentof polysaccharide inZiziphusjujubeMill.from different places was different.Conclusion：Themethod that the content of polysacchride determined was showed advantages of simplicity of operation，system accuracy，high precision and reproducibility and can be used for the quality control ofZiziphus jujubeMill..

ZiziphusjujubeMill.；Polysaccharide；Spectrophotometry；Phenol-sulfuric acidmethod；Quality control

山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（200652）

*劉養(yǎng)清，教授，Tel：（0351）2272085，E-mail：soh2004＠163.com

2011-01-24）