防鳳愈傷組織誘導(dǎo)研究△

畢博，楊世海，徐大衛(wèi)，劉春博

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132109；3.中國(guó)藥材公司，北京 100195；4.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

防鳳愈傷組織誘導(dǎo)研究△

畢博1，2，楊世海1*，徐大衛(wèi)3，劉春博4

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132109；3.中國(guó)藥材公司，北京 100195；4.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

目的：運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)探討防風(fēng)愈傷組織的培養(yǎng)條件。方法：以防風(fēng)葉片為外植體，對(duì)防風(fēng)的愈傷組織進(jìn)行不同濃度生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)。結(jié)果：在2，4-D 1 mg·L－1誘導(dǎo)形成的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好于其他不同濃度，具有顯著差異。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯高于單個(gè)生長(zhǎng)素的處理，生長(zhǎng)情況也有差異。結(jié)論：誘導(dǎo)防風(fēng)最佳外源激素的濃度配比2，4-D 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.5 mg·L－1。

防風(fēng)；愈傷組織；誘導(dǎo)；激素

防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.為傘形科防風(fēng)屬多年生草本植物，俗稱(chēng)北防風(fēng)、東防風(fēng)、關(guān)防風(fēng)、旁風(fēng)、屏風(fēng)、反風(fēng)等[1]。藥用部位是收獲3年生未開(kāi)花結(jié)實(shí)的防風(fēng)根部，此時(shí)的防風(fēng)根漿充足而豐滿，有菊花心，質(zhì)佳，干燥后入藥稱(chēng)“防風(fēng)”。防風(fēng)的藥用成分主要有揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)元素、香豆素、色原酮、漢黃芩素、聚乙炔類(lèi)、腺苷等，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、鎮(zhèn)靜、抗過(guò)敏作用，并具有抗腫瘤免疫促進(jìn)作用及抗凝血作用[2]。防風(fēng)藥材以采挖野生防風(fēng)為主，種源多采自野生種子，但防風(fēng)種子發(fā)芽勢(shì)低。趙敏[3]研究指出，防風(fēng)種子中存在著活性較高的內(nèi)源抑制物質(zhì)，使種子播后出苗緩慢、出苗不齊，往往造成生產(chǎn)田缺苗甚至毀地重種。采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育防風(fēng)時(shí)間短、速度快、成本低，對(duì)于保存防風(fēng)的種質(zhì)資源、合理開(kāi)發(fā)利用中藥資源、滿足市場(chǎng)對(duì)防風(fēng)的大量需求具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前關(guān)于防風(fēng)的研究主要在植物資源、化學(xué)成分、中藥鑒定、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面[4-5]，有關(guān)防風(fēng)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷組織的研究很少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究了不同濃度生長(zhǎng)素和激素對(duì)防風(fēng)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為防風(fēng)優(yōu)良無(wú)性系的繁殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

防風(fēng)種子于2009年9月采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥材基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊世海教授鑒定為防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.種子。

2 方法

選擇健康飽滿的防風(fēng)種子，先在無(wú)菌水中浸泡10～12 h后，小心剝?nèi)シN皮（避免損傷胚），置于超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇中浸泡30 s后，倒去乙醇，置于0.1%氯化汞表面消毒10 min（其間要不停搖動(dòng)），倒去氯化汞，用無(wú)菌水沖洗3～5次，接種到MS培養(yǎng)基上，獲得無(wú)菌苗，待苗長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)備用。

取上述無(wú)菌苗，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，所有培養(yǎng)基中蔗糖的含量均為25 mg·L－1，瓊脂的含量為0.7%，pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min，冷卻后備用。

培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，在愈傷組織誘導(dǎo)階段先采用暗培養(yǎng)，4 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，以日光燈為光源，連續(xù)光照12 h·d－1，光強(qiáng)1 200～1 600 lx。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)其生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷組織數(shù)量并計(jì)算誘導(dǎo)率，同時(shí)記錄愈傷組織的質(zhì)地、顏色及生長(zhǎng)情況。

誘導(dǎo)率＝（形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體的塊數(shù)）×100%

將防風(fēng)外植體分別接種在含有2，4-D、NAA、6-BA的濃度分別為 0，0.3，0.5，1.0，1.2，1.5 mg·L－1的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)的研究。外源激素6-BA 0.5 mg·L－1與NAA、2，4-D配比使用，設(shè)8個(gè)處理，濃度分別為0.3，0.5，1.0，1.2 mg·L－1。

以上每個(gè)處理培養(yǎng)5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10塊外植體，重復(fù)3次，待愈傷組織長(zhǎng)出后觀察生長(zhǎng)情況，計(jì)算誘導(dǎo)率。

3 結(jié)果與分析

利用單獨(dú)或配比使用2，4-D和6-BA，附加在MS基本培養(yǎng)基上，接種30 d后觀察統(tǒng)計(jì)，研究不同種類(lèi)及濃度的激素對(duì)防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

3.1 不同濃度2，4-D對(duì)防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響

表1反映了不同濃度2，4-D對(duì)防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響，2，4-D對(duì)防風(fēng)葉片的愈傷組織有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，在不添加2，4-D的培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)出愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，以1.0 mg·L－1的誘導(dǎo)率最高，高濃度的2，4-D反而抑制了愈傷組織的誘導(dǎo)；從愈傷組織生長(zhǎng)情況來(lái)看，在濃度為1.0 mg·L－1時(shí)，愈傷組織具有很好的光澤，且生長(zhǎng)狀況最好，顏色為乳白色。低濃度和高濃度的2，4-D均導(dǎo)致愈傷組織生長(zhǎng)變差，當(dāng)濃度達(dá)到1.2 mg·L－1時(shí)，大部分呈灰褐色，濃度為1.5 mg·L－1時(shí)，抑制了外植體產(chǎn)生愈傷組織，所產(chǎn)生的愈傷組織呈褐色，不能正常生長(zhǎng)，可能是因?yàn)楦邼舛鹊?，4-D會(huì)誘導(dǎo)愈傷組織內(nèi)多酚氧化酶活性升高，從而導(dǎo)致愈傷組織褐化。

表1 不同濃度2，4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響

3.2 不同濃度NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響

表2反映了不同濃度NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響，可以看出NAA對(duì)防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo)作用也較強(qiáng)。在不添加NAA的培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)出愈傷組織，添加不同濃度的NAA均能誘導(dǎo)出愈傷組織。以0.5 mg·L－1的NAA誘導(dǎo)率最高，愈傷組織生長(zhǎng)好，呈乳白色，具光澤，轉(zhuǎn)接后長(zhǎng)勢(shì)好。但當(dāng)NAA濃度增加為1.0 mg·L－1以上時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢。當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.5 mg·L－1時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)狀況變差，誘導(dǎo)率也逐漸降低。這是因?yàn)榈蜐舛鹊纳L(zhǎng)素能促進(jìn)生長(zhǎng)，超過(guò)適宜濃度，由于生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)產(chǎn)生乙烯而干擾內(nèi)部生理平衡，從而抑制生長(zhǎng)[6-7]。

表2 NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響

3.3 不同濃度6-BA對(duì)防風(fēng)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

表3反映了不同濃度6-BA對(duì)防風(fēng)愈傷組織生長(zhǎng)的影響，可以看出6-BA也是誘導(dǎo)防風(fēng)葉片產(chǎn)生愈傷組織的關(guān)鍵因素。在不添加6-BA的培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)出愈傷組織，添加不同濃度的6-BA均能誘導(dǎo)出愈傷組織。當(dāng)6-BA的濃度為0.5 mg·L－1時(shí)誘導(dǎo)率高，愈傷組織呈黃綠色，有光澤，生長(zhǎng)好，是培養(yǎng)防風(fēng)產(chǎn)生愈傷組織的適宜濃度。當(dāng)6-BA的濃度小于0.5 mg·L－1時(shí)，誘導(dǎo)率低，誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色較暗，生長(zhǎng)差；當(dāng)濃度在1.0 mg·L－1以上時(shí)，有少量愈傷組織產(chǎn)生，且生長(zhǎng)緩慢。由于6-BA在適宜的濃度具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化及物質(zhì)的合成和運(yùn)輸、影響細(xì)胞中各種酶的活性等作用[8]，如果濃度過(guò)低，容易形成多核體阻止細(xì)胞分化，加速細(xì)胞衰老，逐漸死亡；而高濃度的6-BA使細(xì)胞體積因強(qiáng)烈的分裂活動(dòng)而急劇縮小，已形成的愈傷組織不能正常生長(zhǎng)，逐漸變褐[9]。

表3 不同濃度6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響

3.4 外源激素組合對(duì)防風(fēng)愈傷組織的影響

表4反映了外源激素組合對(duì)防風(fēng)愈傷組織的影響。從誘導(dǎo)率方面來(lái)看，適宜濃度的2，4-D與6-BA組合、NAA與6-BA組合的誘導(dǎo)率均較高。結(jié)合生長(zhǎng)情況及愈傷組織誘導(dǎo)出后發(fā)育情況來(lái)看，2.4-D 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.5 mg·L－1組合不僅生長(zhǎng)好，愈傷組織呈淺黃色，具光澤，約20 d后，愈傷組織呈黃綠色，質(zhì)地較緊密[10]。

比較了不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA單獨(dú)使用及組合使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)。單獨(dú)使用3種植物外源激素在一定濃度范圍內(nèi)均能誘導(dǎo)出愈傷組織；配合使用外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素能獲得誘導(dǎo)率高、生長(zhǎng)快、質(zhì)量好的愈傷組織[11]；較佳組合的培養(yǎng)基為 MS＋2，4-D 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.5mg·L－1和 MS＋NAA 0.5 mg·L－1＋6-BA 0.5 mg·L－1；低濃度的2，4-D對(duì)防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，但2，4-D濃度高時(shí)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有抑制作用。

表4 外源激素組合對(duì)愈傷組織的影響

4 小結(jié)與討論

一般來(lái)說(shuō)，激素及其組合的不同，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)也起著關(guān)鍵作用，其中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是兩類(lèi)主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的植物激素。已有研究證實(shí)，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)與分化具有協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合對(duì)細(xì)胞分化起著重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。在防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中2，4-D和NAA的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的激素對(duì)防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，但激素濃度過(guò)高時(shí)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有抑制作用。

比較愈傷組織的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果好，尤以1 mg·L－1的2，4-D誘導(dǎo)形成的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好，呈顆粒狀，疏松、乳白色，與其他濃度比較具有顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯高于單個(gè)生長(zhǎng)素的處理，生長(zhǎng)情況也有差異。誘導(dǎo)防風(fēng)愈傷組織最佳外源激素的濃度配比為2，4-D 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.5 mg·L－1。本研究結(jié)果未對(duì)防風(fēng)愈傷組織有效成分進(jìn)行比較，防風(fēng)有效成分含量很多，這一方面的深入研究我們正在進(jìn)行，將為防風(fēng)的高效快速繁殖開(kāi)拓新的領(lǐng)域。

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Study on Induction of Sapashnikovia divaricata Callus

BIBo1，2，YANG Shi-hai1，XU Da-wei3，LIU Chun-bo4
（1.JinlinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege，Jilin132109，China；3．ChinaNationalCorp．ofTraditional＆HerbalMedicine，Beijing100195，China；4.JilinProvinceEconomicsandManagementCadresCollege，Changchun130012，China）

Objective：To investigate the culture conditions for callus induction inSaposhnikoviadivaricata.Methods：With the blade ofSaposhnikoviadivaricataas explant，to induce the callus with different concentration of auxin and cytokinin.Results：The callus grew significantly better in conduction with 2，4-D 1 mg·L－1than in other conditions.When auxin andcytokinins were used together，callus induction rate was significantly higher than single auxin.Conclusion：The optimal culture condition for callus induction is 2，4-D 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.5 mg·L－1.

Saposhnikoviadivaricata；Callus；Induction；Plant growth regulator

吉林省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目——防風(fēng)多倍體種質(zhì)資源創(chuàng)新技術(shù)研究

*楊世海，E-mail：jlyangs＠163.com

2011-03-29）