HPLC法測(cè)定益精靈口服液中二苯乙烯苷的含量

賴 艷，溫 悅，貝瑩珽，傅正毅，孟德勝#(.第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 40004;.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 40006;.蚌埠醫(yī)學(xué)院，蚌埠 000)

益精靈口服液主要含何首烏、補(bǔ)骨脂等中藥，有健腦安神、滋補(bǔ)肝腎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及預(yù)防感冒等作用，同時(shí)對(duì)無眠多夢(mèng)、健忘、腰酸膝軟、神疲乏力及更年期綜合征也有良好的療效，其中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-Ο-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱二苯乙烯苷)為何首烏的主要成分之一。為了控制該藥的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中主藥何首烏所含有效成分二苯乙烯苷的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供有效、可行的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);Sartorius BT 25S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);KQ-50B型超聲波清洗儀(昆明市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

二苯乙烯苷對(duì)照品(批號(hào):110844-200908，中國(guó)藥品生物制品檢定所);益精靈口服液;甲醇和乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(250 ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(22∶78);柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;流速:1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制:精密稱取二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品1.6 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為160 μg·mL－1二苯乙烯苷溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制:精密量取益精靈口服液2 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用甲醇按1∶1稀釋，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照品的配制:按益精靈口服液處方比例取缺何首烏藥材制成溶液，再按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 系統(tǒng)專屬性實(shí)驗(yàn):分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。二苯乙烯苷對(duì)照品色譜的保留時(shí)間約為10 min，供試品中的二苯乙烯苷與其他雜質(zhì)分離度良好，分離度大于1.5，保留時(shí)間約為10 min，陰性對(duì)照品色譜在二苯乙烯苷相應(yīng)位置處無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖 Fig1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液置10 mL棕色容量瓶中，配制得9個(gè)不同梯度的對(duì)照品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μg·mL－1)，依次精密進(jìn)樣10 μL，在“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)(μg·mL－1)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=31.75C －3.56，(r=0.999 9，n=9)。結(jié)果表明:二苯乙烯苷濃度在0.625～160 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn):取高(160 μg·mL－1)、中(10 μg·mL－1)、低(0.625 μg·mL－1)3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件于1 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，以及連續(xù)3 d分別進(jìn)樣，計(jì)算各成分濃度的RSD，進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度考察，結(jié)果日內(nèi)精密度RSD＜1.91%(n=5)，日間精密度RSD＜2.97%(n=3)。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一批號(hào)(批號(hào):20100622)的益精靈口服液平行試驗(yàn)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果二苯乙烯苷的平均含量為10.52 μg·mL－1，RSD 為 1.69%。

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取本品按上述供試品溶液制備方法制備，制備后分別放置0、5、10、20 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。RSD=2.24%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取9份已知含量的益精靈口服液，每3份為1組，每組分別精密加入濃度為850 μg·mL－1的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液2.0、1.0、0.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab1 Results of recovery test of samples(n=9)

2.3.7 樣品含量測(cè)定:取益精靈口服液樣品(批號(hào):20100622、20100928、20101215，)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，共3次，計(jì)算得益精靈口服液樣品中二苯乙烯苷的含量分別為 10.23、9.88、8.38 μg·mL－1，RSD 值分別為 1.34%、2.21%、1.58%(n=3)。

3 討論

何首烏為益精靈口服液的主藥?，F(xiàn)代藥理研究證明［1］，何首烏具有抗衰老、降血脂以及免疫、護(hù)肝等作用，何首烏中二苯乙烯苷類成分具有廣泛的心血管活性、免疫調(diào)節(jié)、保肝等作用。《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)何首烏及其炮制品制何首烏采用了指標(biāo)性成分二苯乙烯苷的含量高低作為質(zhì)量控制的依據(jù)［2］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)象二苯乙烯苷對(duì)光不穩(wěn)定，因此在配制時(shí)采用避光操作，并使用棕色容量瓶，供試品溶液也選擇在臨用前新配制。實(shí)驗(yàn)色譜柱曾選用 Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)和 Agilent C18(250 ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相均為乙腈-水［2］，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。結(jié)果兩種色譜柱分離度均很好，系統(tǒng)適應(yīng)性較好，保留時(shí)間在8～15 min。兩種種色譜柱所得供試品含量結(jié)果均在誤差范圍內(nèi)，說明該含量測(cè)定的耐用性較好。在樣品測(cè)定中，最后選擇Diamonsil C18色譜柱。流動(dòng)相曾采用乙腈-水、甲醇-水［3，4］、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸［5］體系，乙腈-水體系，柱效較高且分離度好且保留時(shí)間合適。在多個(gè)流動(dòng)相比例中，最后確定乙腈∶水=22∶78，作為流動(dòng)相，樣品的保留時(shí)間較為合適，分離度良好，陰性對(duì)照沒有干擾。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法建立了益精靈口服液中二苯乙烯苷的含量方法。測(cè)定益精靈口服液中的二苯乙烯苷的含量為10.52 μg·mL－1，本實(shí)驗(yàn)所建立的測(cè)定方法，簡(jiǎn)單可行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效的控制益精靈口服液的質(zhì)量。

［1］蘇 瑋，郭 群.何首烏的現(xiàn)代藥理研究概況［J］.中草藥，1997，28(2):119.

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