基因敲除豬終獲成功加速異種器官移植

文/高妍 張琳

基因敲除豬終獲成功加速異種器官移植

文/高妍 張琳

潘登科，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所副研究員、博士，主要從事豬體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因及胚胎干細(xì)胞研究，在轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆豬和體細(xì)胞基因敲除豬等研究方面取得了一批國(guó)內(nèi)外領(lǐng)先成果。2010年獲得我國(guó)首例敲除α1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α1，3GT）基因的器官移植豬7頭，為創(chuàng)建抗超急性免疫排斥反應(yīng)的器官移植豬邁出了關(guān)鍵的一步。2010年獲得敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN基因的雙肌豬31頭，建立了高效的體細(xì)胞基因敲除克隆豬技術(shù)平臺(tái)，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。獲2008年“神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)”一等獎(jiǎng)（體細(xì)胞克隆豬和轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆豬技術(shù)平臺(tái)的建立與應(yīng)用，排名第6）、2010年國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)（牛和豬體細(xì)胞克隆研究及應(yīng)用，排名第9）。

隨著人體器官移植技術(shù)的日趨成熟，器官供體短缺成為阻礙人們追求健康的最大因素。如何解決器官供體不足的難題，已經(jīng)成為全社會(huì)普遍關(guān)注的問題。

2010年11月，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所成功研制出的4頭敲除α1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α1，3GT）單等位基因的近交系五指山小型豬，為我國(guó)創(chuàng)建抗超急性排斥反應(yīng)的器官移植豬邁出了關(guān)鍵的一步，有助于加速我國(guó)異種器官移植研究。該項(xiàng)目負(fù)責(zé)人潘登科副研究員介紹：“這是我國(guó)第一例敲除超急性免疫排斥基因的異種器官移植豬，已經(jīng)通過中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的分子鑒定。它的成功研制，使我國(guó)成為世界上少數(shù)幾個(gè)獲得成功的國(guó)家之一?！?/p>

攻堅(jiān)克難 服務(wù)于人

“所謂克隆，就是一種無性繁殖，簡(jiǎn)單說就是借助卵子將一個(gè)體細(xì)胞變成一個(gè)胚胎，經(jīng)過卵子重新程序化，最終生產(chǎn)出個(gè)體?！迸说强平榻B，不同動(dòng)物有不同的生理特征，在胚胎構(gòu)建、胚胎培養(yǎng)和移植等方面都有差異，因此不同動(dòng)物的克隆技術(shù)也存在很大的區(qū)別。與牛羊相比，克隆豬的卵子成熟質(zhì)量更差，體外操作更難把握，成功難度也更大。

克隆豬研究最大的應(yīng)用是異種器官移植，除了可作為眾所周知的器官水平上的重要臟器的移植供體，還能夠?qū)嵤┘?xì)胞的移植，比如已有猴子實(shí)驗(yàn)證明的胰島細(xì)胞移植可治療糖尿病。此外，克隆豬研究還是轉(zhuǎn)基因疾病模型的建立和轉(zhuǎn)基因豬育種等研究工作的基礎(chǔ)。

潘登科介紹，這次實(shí)驗(yàn)使用的近交系五指山小型豬是我國(guó)自主培育的，它在解剖、生理結(jié)構(gòu)、代謝機(jī)制、器官發(fā)育等多方面與人更為相近，是人類異種器官移植的理想供體。而近交系豬具有基因高度純合、遺傳性狀穩(wěn)定、表型均一和遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，有助于推動(dòng)異種器官移植臨床前實(shí)驗(yàn)研究。目前國(guó)內(nèi)有不少實(shí)驗(yàn)室在克隆豬領(lǐng)域開展工作，現(xiàn)在已有七八個(gè)實(shí)驗(yàn)室能做出克隆豬，但能做出基因敲除豬的只有三個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

做基因敲除豬最大的難題就是如何做好體細(xì)胞基因打靶?！绑w細(xì)胞基因打靶的效率非常低，只有百萬分之一甚至千萬分之一。”潘登科在提到細(xì)胞篩選工作時(shí)說，“篩選半年拿到了2000個(gè)克隆點(diǎn)，但鑒定后才發(fā)現(xiàn)只有幾個(gè)是陽性的，這個(gè)工作量是很大的。”為解決這一難題，潘登科團(tuán)隊(duì)在核移植胚胎干細(xì)胞（ntES細(xì)胞）的分離和培養(yǎng)方面開始了探索，利用ES細(xì)胞進(jìn)行基因打靶可大大提高轉(zhuǎn)基因的效率，進(jìn)而提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的效率。

豬器官移植給人要解決的關(guān)鍵技術(shù)是超急性免疫排斥反應(yīng)，而豬體內(nèi)的α1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因所產(chǎn)生的α1，3半乳糖表位是引起超急性免疫排斥的主要因素，潘登科團(tuán)隊(duì)采用體細(xì)胞基因敲除和克隆技術(shù)，敲除α1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因，為最終獲得抗超急性免疫排斥的體細(xì)胞克隆豬奠定了基礎(chǔ)。

下一步，他們的目標(biāo)是用至多兩年的時(shí)間，解決其他排斥反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)做一些臨床前的研究工作。所謂臨床前研究，就是先將器官移植到與人很接近的猴子身上進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)，解決排斥反應(yīng)、臨床疾病等各種可能存在的問題，最終為人的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。但潘登科說，要真正用到人的身上，還不能著急，要做實(shí)，將風(fēng)險(xiǎn)降到最低，更好地服務(wù)于人。

兩次成果 轟動(dòng)全國(guó)

2005年7月，潘登科博士畢業(yè)來到現(xiàn)在的單位—中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所基因與細(xì)胞工程室，進(jìn)行豬轉(zhuǎn)基因克隆和胚胎干細(xì)胞研究。幾年間，他取得了諸多的成績(jī)：他對(duì)豬體細(xì)胞核移植技術(shù)體系進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，在卵母細(xì)胞體外成熟液中添加促減數(shù)分裂甾醇（MAS），提高了卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量；在胚胎重新程序化上，他利用TSA（去乙?；种苿┨幚碓缙谂咛ィ岣吡丝寺∨咛サ哪遗甙l(fā)育率；在核移植供體細(xì)胞類型方面，他探索利用五指山小型豬胎兒成纖維細(xì)胞、新生豬骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和成年豬前脂肪細(xì)胞三種類型的體細(xì)胞為核供體，生產(chǎn)體細(xì)胞克隆胚胎和轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因的體細(xì)胞克隆胚胎。

在基因敲除豬成功之前，潘登科和他的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)兩次轟動(dòng)中國(guó)克隆界。

潘登科參加2008年第五屆亞洲繁殖大會(huì)，并主持專題報(bào)告、作大會(huì)報(bào)告。

潘登科團(tuán)隊(duì)

第一次是2005年，當(dāng)時(shí)的潘登科還在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士課題研究。在導(dǎo)師吳常信院士和李寧院士的指導(dǎo)下，潘登科和當(dāng)時(shí)的同學(xué)張運(yùn)海博士共同合作，成功獲得了我國(guó)首例體細(xì)胞克隆豬，首次在國(guó)內(nèi)報(bào)道了利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)豬轉(zhuǎn)基因囊胚；首次在國(guó)際上報(bào)道了不同氧分壓環(huán)境下成熟培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞支持克隆胚胎早期發(fā)育的能力相似；在世界上首次嘗試?yán)?℃冷藏的豬胎兒成纖維細(xì)胞為供體開展轉(zhuǎn)基因克隆胚胎生產(chǎn)。

另一次是2008年北京奧運(yùn)會(huì)期間，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所和河北省玉田種豬場(chǎng)（玉田縣牧富種豬繁育有限公司）共同合作，培育出我國(guó)首批轉(zhuǎn)“ω-3”脂肪酸去飽和酶基因的克隆豬，脂肪酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肌肉中ω-3多不飽和脂肪酸提高了13倍多。這種轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)富含的ω-3多不飽和脂肪酸，是深海魚油的主要成分，能夠維持體內(nèi)脂肪酸平衡，調(diào)節(jié)血脂，降低血膽固醇，預(yù)防冠心病、高血壓、腦中風(fēng)等心腦血管疾病。這項(xiàng)研究的成功，是我國(guó)轉(zhuǎn)基因克隆豬制備上取得的重要進(jìn)展，為轉(zhuǎn)基因豬新品種培育奠定了重要基礎(chǔ)，使我國(guó)成為繼美國(guó)之后第一個(gè)培育出富含“魚油”轉(zhuǎn)基因克隆豬的國(guó)家。

基因敲除豬項(xiàng)目是潘登科團(tuán)隊(duì)2009年開始研究的，靠自身一步步摸索，在不斷的失敗中慢慢摸索，最終取得成功。這項(xiàng)研究也得到了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所陳紅星研究員、南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院、北京市畜牧獸醫(yī)總站和北京安定種豬場(chǎng)等的協(xié)助。

精誠(chéng)協(xié)作 風(fēng)雨向前

潘登科自小喜歡安靜，喜歡做研究，做事喜歡較真。不管是碩士期間的技術(shù)啟蒙人、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所首席科學(xué)家陳大元研究員，還是給自己奠定做大做強(qiáng)基礎(chǔ)的博士導(dǎo)師李寧院士，抑或是曾經(jīng)的師兄師姐、現(xiàn)在的研究團(tuán)隊(duì)，潘登科都心存感激。潘登科說，自己從他們身上學(xué)到了很多優(yōu)秀的品質(zhì)，懂得了什么是做科研、什么是團(tuán)隊(duì)協(xié)作、什么叫榜樣的力量……

潘登科說自己能取得今天的成績(jī)，離不開同行的幫助和團(tuán)隊(duì)的努力?！拔覀冇锌寺〖夹g(shù)的保障，有軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所陳紅星研究員在基因工程方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，我們是在多方堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)之上進(jìn)行的綜合研究。怎樣構(gòu)建好一個(gè)打靶的載體，如何做好細(xì)胞篩選……”潘登科團(tuán)隊(duì)通過無數(shù)次的實(shí)驗(yàn)解決細(xì)胞不純、細(xì)胞老化等問題，一點(diǎn)點(diǎn)向前推進(jìn)，逐漸摸索出了自己的研究思路和研究方法，最終取得成果，并達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。

“誰都想為社會(huì)做出漂亮的工作，在基因敲除豬這方面，我們覺得很有自信！”潘登科提到自己和團(tuán)隊(duì)的研究工作時(shí)不無自豪地說，“剛開始的時(shí)候，大家都覺得是天方夜譚，可我們經(jīng)過努力做出來了。目前在世界上我們的技術(shù)也是非常棒的，而且我們做的工作很有分量，是貼合國(guó)際發(fā)展潮流、滿足國(guó)家戰(zhàn)略發(fā)展需要的。”

現(xiàn)在潘登科的動(dòng)物克隆和轉(zhuǎn)基因研究組共有7個(gè)研究人員，個(gè)個(gè)都是有著過硬技術(shù)的好手，精誠(chéng)協(xié)作的精神使具有不同專長(zhǎng)的他們，能夠在研究的過程中獲得最大化的效能。他們始終本著對(duì)科研高度負(fù)責(zé)的態(tài)度，以高效生產(chǎn)具有重要研究和應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為自己的最終目標(biāo)。

2010年，潘登科團(tuán)隊(duì)又獲得了敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN基因豬31頭，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

潘登科介紹，現(xiàn)在和未來的一段時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室將充分利用自身優(yōu)勢(shì)—克隆技術(shù)平臺(tái)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)和細(xì)胞篩選平臺(tái)，并調(diào)配精力到轉(zhuǎn)基因豬遺傳分析和功能鑒定方面?！澳玫睫D(zhuǎn)基因豬以后，我們需要對(duì)基因的功能、表型等從分子水平、蛋白水平等做一系列的鑒定，確定轉(zhuǎn)基因豬的應(yīng)用價(jià)值?！苯酉聛恚麄冞€打算將現(xiàn)在比較強(qiáng)調(diào)克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的實(shí)驗(yàn)室，打造成更加全面、具備更系統(tǒng)研究功能和評(píng)價(jià)體系的平臺(tái)。

現(xiàn)在，敲除α1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的體細(xì)胞克隆豬和敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素MSTN基因豬即將進(jìn)入擴(kuò)繁和功能評(píng)價(jià)研究。任重道遠(yuǎn)，未來等待潘登科及其研究團(tuán)隊(duì)完成的任務(wù)還很多。

富含ω-3多不飽和脂肪酸的克隆豬

敲除α1，3GT單等位基因的近交系五指山小型豬