豬2型圓環(huán)病毒自家組織滅活苗的研制及其免疫效果觀察

梁俊昌 許瑞利 朱瑞良

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豬2型圓環(huán)病毒自家組織滅活苗的研制及其免疫效果觀察

梁俊昌①②許瑞利①②朱瑞良①

（①山東農業(yè)大學動物科技學院 泰安 271018 ②山東省棗莊市市中區(qū)畜牧獸醫(yī)局）

本試驗通過檢測細胞組織培養(yǎng)PCV2滅活疫苗與自家細胞免疫后PCV2抗體水產(chǎn)，結果表明，自家組織滅活苗是預防PCV2行之有效的辦法。

PCV2 自家組織滅活菌 免疫

豬2型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)病是當今養(yǎng)豬業(yè)流行的傳染病之一，在現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)豬場中，PCV2往往與其他疫病混合感染[1]，發(fā)病率呈上升趨勢。該病的廣泛流行和蔓延已給世界各國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴重威脅和經(jīng)濟損失[2]。本試驗對自家組織苗在某些豬場應用的效果進行了測定。

1 材料和方法

1.1 材料

滅活疫苗-藍圓二聯(lián)苗(某高等院校研究所中試產(chǎn)品)；自家組織苗：選試驗豬場PCV2發(fā)病豬典型間質性肺炎病料，嚴格按自家組織苗制作程序制作，經(jīng)0.4%甲醛滅活，恒溫汽浴振蕩培養(yǎng)箱37℃滅活36h，冷藏備用；圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒；美國伯樂公司680型全自動酶標儀。

1.2 方法與步驟

1.2.1 分組和預試 42日齡健康豬45頭，隨機分為A、B、C3組，每組15頭，分3欄飼養(yǎng)，每組按1~15的順序逐頭打耳缺編號，觀察7d，無異常，正式試驗。

1.2.2 試驗前采血和初免 試驗豬49日齡，3個組同時逐頭前腔靜脈采血5ml，隨即頸部肌肉注射相應疫苗或生理鹽水：A組(試驗I組)每頭免疫試驗用藍圓二聯(lián)苗3ml；B組(試驗II組)每頭免疫試驗用自家組織苗3ml；C組(對照組)每頭注射生理鹽水3ml。所采血樣常溫析出血清，按分組對應編號標記，-20℃冷凍保存待檢。

1.2.3 初免抗體檢測采血和二免 試驗豬70日齡采血，試驗組逐頭免疫相同種類和劑量的疫苗，對照組仍每頭注射生理鹽水3ml。所采血樣析出血清，編號保存。

1.2.4 二免抗體檢測采血 試驗豬91日齡，全部試驗豬逐頭前腔靜脈采血5ml，所采血樣依上述1.2.2和1.2.3析出血清，編號保存。

1.2.5 抗體檢測和統(tǒng)計分析 把所采血清，逐份ELISA檢測PCV2抗體，血清抗體OD值依分組編號逐頭登記。按統(tǒng)計學方法比較各組方差及OD均值差異顯著性。

1.2.6 試驗豬群觀察 試驗開始后，逐日觀察各試驗組和對照組群體的生長、采食、發(fā)病情況及外觀表現(xiàn)，以判斷不同疫苗對PCV2的免疫效果。

2 結果與分析

2.1 PCV2抗體的檢測結果和統(tǒng)計分析

試驗各組不同階段PCV2抗體ELISA檢測結果表1。為從統(tǒng)計學上判斷各組免疫前后抗體水平變化是否存在差異，對各組不同階段的抗體水平逐對作成對雙樣本均值分析t檢驗，檢驗結果如表2。

表1 各試驗組與對照組免疫的不同階段PCV-2抗體檢測結果

表1、表2數(shù)據(jù)顯示：試驗I組經(jīng)藍圓二聯(lián)滅活苗1次免疫21d后，血清抗體陽性率從40.00%上升至79.31%，OD均值上升，但與一免前差異不顯著。2次免疫21d后，陽性率從79.31%上升至100%，OD均值進一步上升，且與二免前差異極顯著。試驗II組經(jīng)自家組織苗1次免疫21d后，陽性率從56.66%上升至100%，OD均值上升，與1免前差異極顯著。2次免疫21d后，陽性率仍是100%，OD均值繼續(xù)上升，且與2免前差異極顯著。

表2 PCV2血清抗體檢測結果的統(tǒng)計學檢驗

2個試驗組分別經(jīng)2次藍圓二聯(lián)苗和自家組織苗免疫后，血清PCV2抗體水平都能有效上升。雖然從統(tǒng)計學角度，試驗I組一免21d后與一免前血清抗體水平對比，差異不顯著，但其抗體陽性率及OD均值都有明顯提高或上升(OD均值由0.153上升至0.3062)，且P(|t|>tα/2)＝0.0729，已經(jīng)很接近H0的拒絕域(0.025)，尚不能據(jù)此否認該組一免21d后血清抗體水平顯著上升。要確知抗體是否顯著上升，仍需進一步試驗數(shù)據(jù)。

對照組經(jīng)1次注射生理鹽水21d后，血清抗體陽性率從70%下降至56.67%，OD均值下降，但與1次注射生理鹽水前差異不顯著。2次注射生理鹽水21d后，抗體陽性率進一步下降到53.33%，但OD均值卻有所上升，且與2次注射生理鹽水前差異極顯著。不能把這一抗體水平顯著上升歸因于注射生理鹽水。因OD均值上升的同時，抗體陽性率卻進一步下降，OD均值的上升，不是總體普遍上升的結果，而是個別樣本超常上升的影響。這種結果，可能與個別試驗樣本PCV2自然感染有關。

2.2 免疫效果觀察

試驗II組(自家組織苗免疫組)豬群從初次免疫開始，到20周齡，生長一直正常，與該場正常豬無異。試驗I組(藍圓二聯(lián)苗組)和對照組(生理鹽水組)從12周齡開始，逐漸表現(xiàn)出與該場未使用自家組織苗免疫以前豬群散發(fā)性PCV2流行期間完全相同的癥狀。直到15周齡補注射自家組織苗，17周齡加強免疫1次；并在每次注射苗前3d開始，連續(xù)7d飼料中添加抗生素協(xié)助預防和治療，豬群才開始逐步恢復正常。

3 討論

試驗結果表明，在市場未有免疫效果確切的PCV2疫苗銷售以前，采集自場病豬典型間質性肺炎病料制作自家組織苗，仍是預防PCV2行之有效的辦法。豬群經(jīng)細胞培養(yǎng)PCV2制作的滅活苗免疫后，PCV2抗體顯著上升，但不能有效預防PCV2發(fā)病。說明PCV2的結構蛋白抗體，不能有效預防PCV2發(fā)病。自家組織苗中含有PCV2與其他病原或有機微粒融合體這一可能性外，還可能有以下2種原因：（1）PCV2寄生靶細胞問題。PCV2與HIV(愛滋病毒)具有很大的相似性，都是在免疫細胞內寄生和復制。HIV疫苗之所以20多年至今仍未研制成功，除了因為HIV存在頻繁變異外，還因為它寄生在人體免疫細胞，其中和抗體無法有效突破免疫細胞固有的免疫屏障，中和在細胞內寄生的HIV。傳統(tǒng)疫苗通過激發(fā)免疫細胞的免疫方式，對HIV免疫沒有任何效果[3]。（2）病毒。細胞系統(tǒng)分泌蛋白對病毒的免疫作用：已有的研究證實，昆蟲的桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)，可高水平表達外源蛋白—多角體蛋白，這些蛋白覆蓋并保護著核體內的病毒粒子。通過提純這種蛋白，可對動物產(chǎn)生一定的免疫源性。使用間質性肺炎病料制作自家組織苗之所以能較好地預防PCV2發(fā)病，也可能因為PCV2感染肺泡細胞后，刺激肺泡細胞產(chǎn)生某種分泌蛋白，這種分泌蛋白對PCV2具有某種保護作用，或者促進其在機體內復制。機體經(jīng)這種分泌蛋白免疫后，能有效中和這種分泌蛋白[4]，從而抑制PCV2在機體內復制，或使PCV2在機體內失去保護屏障，無法在細胞內生存，使PCV2不發(fā)病。

[1] 孫艷明, 趙德明. 豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2006, 33(7): 62-64.

[2] 陳艷紅,郭鑫,趙榮茂,等.我國規(guī)?；i場主要繁殖障礙性病毒病的血清學調查[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2007,43(6):33-35.

[3] 胡蘭銀, 張騫, 肖建鋒等. 引起豬發(fā)病死亡主要疫病的病原學調查[J]. 畜禽業(yè), 2007,32(12):15-17.

[4] 邱艷紅, 吳峻華, 葉瑋等. 福州市豬圓環(huán)病毒(PCV-2)血清學調查[J].中國獸醫(yī)雜志, 2005, 41(8): 26-27.

（2011–03–23）

S852.5+2

A

1007-1733(2011)04-0013-02