利用RT-PCR對(duì)病料中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)

許瑞利 梁俊昌 朱瑞良

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利用RT-PCR對(duì)病料中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)

許瑞利①②梁俊昌②朱瑞良①

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018 ②山東省棗莊市市中區(qū)畜牧獸醫(yī)局）

本試驗(yàn)對(duì)棗莊市中區(qū)6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)及周邊地區(qū)的54個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)及散戶所采集的172份臨床疑似“豬高熱病”樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棗莊地區(qū)檢出高致病性PRRSV陽(yáng)性占56.4%(97/172)，CSFV陽(yáng)性占31.4%(54/172)。PRRSV和CSFV的混合感染占12.2%(21/172)，說(shuō)明棗莊地區(qū)大部分豬場(chǎng)已經(jīng)普遍存在PRRSV感染。

PRRSV 多重 RT-PCR CSFV 感染

近年來(lái)，隨著棗莊地區(qū)生豬養(yǎng)殖量的不斷增加，豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory synduome, PRRS)發(fā)生的越來(lái)越頻繁，危害也越來(lái)越嚴(yán)重。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 發(fā)病豬病料采集時(shí)間為2008~2010年，采集棗莊市畜牧獸醫(yī)局獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)門(mén)診病歷，分別來(lái)自棗莊市中區(qū)6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)及周邊地區(qū)的54個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)及農(nóng)村散養(yǎng)戶“疑似豬高熱病”病豬或血樣，共172份病料，包括病豬心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、胎兒組織、胎盤(pán)等臟器或血液樣品。每一病例取部分病變組織3.0g左右，加少量滅菌PBS，用滅菌研磨器研磨至糊狀，再加滅菌PBS釋成乳劑，置-70℃冰箱反復(fù)凍融3次(血清樣品無(wú)需研磨反復(fù)凍融)，3000~4000rpm，4℃離心5min，取上清置-20℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol?Reagent 購(gòu)自Invitrogen 公司，One Step RNA RT-PCR試劑盒(AMV)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DL2000 Marker，購(gòu)自濟(jì)南辰飛生物工程公司；其他化學(xué)試劑如氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 ELX800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，TGL-16G型常溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)，PCR儀、Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，JA1003型電子天平(上海精科天平)，DYYⅢ-31A/31B型電泳槽(北京六一儀器廠)，Gdldoc EQ凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，SUB28型恒溫水浴水槽(英國(guó)Grant公司)，超凈工作臺(tái)(加拿大Canadian Cabinets公司)。

1.1.4 引物 根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1毒株，設(shè)計(jì)合成目的基因PRRSV Nsp2基因片段引物PN1、PN2和擴(kuò)增ORF5基因的引物P51、P52，同時(shí)根據(jù)已發(fā)表的CSFV核酸序列，選擇高度保守性5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)豬瘟引物C51、C52，引物由上海生工生物工程公司合成，使用前用滅菌超純水配成濃度為25μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證PN1、PN2、C51、C52 可以組合為多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)高致病性PRRSV與CSFV(見(jiàn)表1)。

表1 引物設(shè)計(jì) （bp）

1.1.5 RT-PCR相關(guān)溶液配制 按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 用Trizol試劑盒提取病毒總RNA，操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 一步法RT-PCR擴(kuò)增 以病毒RNA核酸為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μl。擴(kuò)增程序?yàn)?0℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94℃變性50s，56℃退火30s，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min，4℃保存。取10μl產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，觀察。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 分別取實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV SX-1變異毒株與CSFV疫苗毒株作為陽(yáng)性對(duì)照，使用表1中4對(duì)引物混合物，分別對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，測(cè)試引物特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定PRRSV SX-1株和CSFV疫苗毒株的混合RNA以確定其基因組RNA的濃度，并將提取的RNA依次做10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取3μl作為模板，進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性。

1.2.5 臨床病料的多重RT-PCR檢測(cè) 利用建立的多重RT-PCR方法對(duì)棗莊地區(qū)的不同規(guī)模豬場(chǎng)及農(nóng)村散養(yǎng)戶“疑似豬高熱病”病豬或血樣進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以PRRSV SX-1株和CSFV疫苗株為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌水作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

分別提取PRRSV SX-1變異毒株與CSFV疫苗毒株，利用表1中4對(duì)引物的混合物，對(duì)上述模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果在PRRSV的模板中，只擴(kuò)增出了大小約為719bp的特異性片段；在含有CSFV的模板中，只擴(kuò)增出了大小約為267bp的特異性片段。同時(shí)對(duì)臨床“疑似高熱病料”進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，反應(yīng)特異性良好。

圖1 引物特異性分析

1:DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2:PRRSV陽(yáng)性對(duì)照；3:CSFV陽(yáng)性對(duì)照；4:永安病料；5:齊村病料

2.2 敏感性試驗(yàn)

用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定得到PRRSV SX-1株與CSFV疫苗毒株的混合基因組RNA濃度為20 μg/ml。將提取的RNA依次做10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取10μl模板，用引物P1和P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示其敏感性為20pg。

圖2 7份臨床病料的多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

1:稅郭病料；2:西王莊病料；3 :DL2000 DNA Marker；4:齊村病料；5:孟莊病料；6:永安病料；7:光明病料8:其他病料；9:陽(yáng)性對(duì)照；10:陰性對(duì)照

2.3 多重RT-PCR檢測(cè)病料

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)兩條特異性擴(kuò)增片段的條帶，大小分別為750bp和260bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。多重RT-PCR 方法檢測(cè)部分樣品的電泳結(jié)果如圖2所示。

表2 棗莊地區(qū)病料多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(2008~2010年)

從表2結(jié)果顯示，2008~2010年間棗莊地區(qū)采集的172份疑似“豬高熱病”樣品高致病性PRRSV陽(yáng)性占56.4% (97/172)，CSFV陽(yáng)性占31.4%(54/172)。PRRSV和CSFV的多重混合感染，陽(yáng)性占12.2%(21/172)。

3 討論

2006年6月份以來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)發(fā)生了“豬高熱病”疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中高致病性PRRSV是導(dǎo)致豬“高熱綜合癥”的主要病原之一，有些病例檢測(cè)到CSFV。目前，很多豬場(chǎng)存在這兩種傳染病，并且CSFV和PRRSV常呈混合感染。本研究發(fā)現(xiàn)，棗莊地區(qū)PRRSV變異株陽(yáng)性病料或豬瘟陽(yáng)性病料，說(shuō)明混合感染已十分普遍和嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)引起養(yǎng)殖場(chǎng)和管理部門(mén)的高度重視。棗莊地區(qū)采集的172份臨床疑似“豬高熱病”樣品，高致病性PRRSV陽(yáng)性占56.4%(97/172)，CSFV陽(yáng)性占31.4% (54/172)。這與王仕榮等在廣西“豬高熱綜合征”主要病原調(diào)查中，檢出率最高的為PRRSV 變異株毒株占59. 59 %(87/ 146)相似，與李維華(2008)等報(bào)道的CSFV感染的陽(yáng)性率較低，僅為3.13%不完全一致。王義桂等(2007)曾報(bào)道近幾年山東省養(yǎng)豬業(yè)存在CSFV和高致病性PRRSV及PRV等多種病毒的混合感染。本試驗(yàn)對(duì)采集的172份樣品進(jìn)行了多重RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，棗莊地區(qū)也均存在PRRSV和CSFV的多重混合感染，陽(yáng)性占12.2%(21/172)，本試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證棗莊地區(qū)豬群中混合感染現(xiàn)象比較普遍。由于PRRSV能引起免疫抑制，促進(jìn)CSFV等病毒的感染，造成細(xì)菌大量繼發(fā)感染，可能加重豬發(fā)病并導(dǎo)致死亡。因此，在今后的疾病防控中，如何提高豬體的免疫力值得重視。此外，對(duì)2009年采集樣品與1010年采集樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，2009年P(guān)RRSV陽(yáng)性為50.0%(31/62)，CSFV陽(yáng)性為24.2%(15/62)，而2010年P(guān)RRSV陽(yáng)性率高達(dá)64.3%(63/98)，CSFV陽(yáng)性率達(dá)到36.7%(36/98)，與近年來(lái)防疫力度有一定關(guān)系。

（2011–03–23）

S858.28

A

1007-1733(2011)04-0011-02