食品中鯊魚源性成分真實(shí)性P CR鑒別研究

郭云霞，包建強(qiáng)，張舒亞，陳 穎，黃文勝，呂 蓉，李 想，高 琴，劉月明

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100025）

食品中鯊魚源性成分真實(shí)性P CR鑒別研究

郭云霞1，2，包建強(qiáng)1，張舒亞2，*，陳 穎3，黃文勝3，呂 蓉2，李 想2，高 琴2，劉月明2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100025）

建立食品中真實(shí)性鯊魚源性成分PCR鑒別方法，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。運(yùn)用普通PCR技術(shù)對9種鯊魚及42種常見非鯊魚類動植物樣品進(jìn)行檢測，9種鯊魚中出現(xiàn)180bp的特異性擴(kuò)增條帶，其他非鯊魚樣品中均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，實(shí)驗(yàn)表明，本檢測方法具有特異性，檢測限為0.1ng/μL鯊魚DNA和0.1%（W/W）鯊魚肉粉。運(yùn)用建立的方法對20種常見的鯊魚產(chǎn)品進(jìn)行PCR檢測，除仿魚翅和鯊魚肝油外，所有產(chǎn)品中均能檢測出鯊魚成分。該檢測方法能夠用于食品中鯊魚源性成分的真實(shí)性鑒別。

食品，鯊魚源性成分，鑒別，PCR

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大青鯊、尖吻斜鋸牙鯊、澳洲半沙條鯊、舒氏星鯊、鼠鯊、加勒比斜鋸鯊、尖吻鯖鯊、兔銀鮫、葉吻銀鮫DNA 由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院提供；虎頭鯊 來自實(shí)驗(yàn)室儲備；孔鰩、黃魚、黑魚、帶魚、鯧魚、鱈魚、鱸魚、扁魚、三文魚、羅非魚、石斑魚、金槍魚、大頭鰱、鰣魚、豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、鵝、兔、草蝦、貽貝、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、紅薯、玉米、海帶、番茄、蕎麥、豌豆、綠豆、扁豆、大豆、蠶豆、豇豆及燕麥等42種常見非鯊魚動植物材料樣品 均來自實(shí)驗(yàn)室儲備；出口日本泡發(fā)魚翅、日本進(jìn)口干魚翅、出口日本干魚翅、泰國進(jìn)口干魚翅、日本進(jìn)口鯊魚肝油 均由上海進(jìn)出口口岸提供；泡發(fā)魚翅、鯊魚肉、干鯊魚鰭、仿干魚翅、泡發(fā)的仿魚翅、干魚翅、凍干魚翅、國產(chǎn)鯊魚肝油、美國天然元公司硫酸軟骨素膠囊、日本百傲鯊公司鯊魚軟骨素膠囊 均購自上海市場或飯店；硫酸軟骨素初級加工品 來自實(shí)驗(yàn)室儲備。

1.2 樣品制備

使用冷凍研磨機(jī)將上述樣品磨成粉末狀，用于物種特異性檢測。

將虎頭鯊肉和草魚肉研磨成粉狀后，80℃烘干12h。用草魚肉粉將上述虎頭鯊肉粉配制成10%、1%、0.1%、0.01%（W/W）的預(yù)混樣品，用于重量靈敏度測試。

1.3 樣品DNA提取

使用天根海洋動物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，目錄號：DP324）提取鯊魚及硬骨魚類樣本DNA，動物基因組提取試劑盒（目錄號：DP323）提取動物樣本DNA，植物基因組提取試劑盒（目錄號：DP305）提取植物樣本DNA，提取方法詳見試劑盒操作說明書。用BioPhotometer plus核酸蛋白含量測定儀（Eppendorf）測定DNA濃度，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

使用18S rRNA基因擴(kuò)增真核生物內(nèi)源基因，以確保所提取的DNA適合于PCR擴(kuò)增。檢測所用18S rRNA基因引物序列為：5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’和5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’。PCR反應(yīng)體系為：1×PCR緩沖液，2.5mmol/L Mg2+，1U Taq酶，200μmol/L dNTPs，引物100nmol/L，模板50～100ng，反應(yīng)體積為25μL。擴(kuò)增條件為：94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40個循環(huán)。

冰上溶解Watcher SHARK試劑盒（海康生命科技有限公司，產(chǎn)品編號：F01-02-1120）中的反應(yīng)試劑。PCR反應(yīng)體系為：5.1μL反應(yīng)試劑，0.1μL Taq酶，12.8μL無菌去離子水，2μL模板DNA（100 ng/μL），反應(yīng)體積為20μL。擴(kuò)增條件為：95℃，10min；95℃，30s，64℃，40s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測

取10μL PCR產(chǎn)物，加1μL 10×上樣緩沖液點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為2%。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物18S rRNA特異引物的檢測結(jié)果

用真核生物18S rRNA特異性引物擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)所提取的所有DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有DNA樣品均出現(xiàn)137bp的特異性擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，所有抽提的DNA溶液均適用于PCR測試。

2.2 鯊魚源性成分引物的特異性檢測結(jié)果

用Watcher SHARK試劑盒對9種鯊魚樣品DNA進(jìn)行6次PCR檢測，均出現(xiàn)180bp左右的特異性擴(kuò)增條帶（圖1）。用Watcher SHARK試劑盒對42種非鯊魚類常見動植物樣品DNA進(jìn)行6次PCR檢測，均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖2）。實(shí)驗(yàn)表明，該鯊魚試劑盒對9種供試鯊魚種類具有特異性。

圖1 鯊魚DNA特異性檢測電泳圖注：M：DNA Marker DL2000；1：鯊魚陽性對照；2：陰性對照；3：加勒比斜鋸鯊；4：鼠鯊；5：大青鯊；6：澳洲半沙條鯊；7：路氏雙髻鯊；8：尖吻斜鋸牙鯊；9：尖吻鯖鯊；10：舒氏星鯊；11：虎頭鯊；12：DNA提取空白。

圖2 非鯊魚動植物DNA特異性檢測電泳圖

2.3 鯊魚源性成分引物的靈敏度檢測結(jié)果

用1×TE緩沖液將提取的虎頭鯊樣品DNA溶液稀釋至10、1、0.1、0.01ng/μL，分別取5μL按上述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定該檢測方法的檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明：10、1、0.1ng/μL的DNA稀釋液均出現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增條帶，0.01ng/μL的虎頭鯊DNA稀釋液未出現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增條帶（圖3）。

圖3 鯊魚DNA檢測靈敏度電泳圖注：M：DNA Marker DL2000；1：鯊魚陽性對照；2：陰性對照；3：10ng/μL虎頭鯊DNA；4：1ng/μL虎頭鯊DNA；5：0.1ng/μL虎頭鯊DNA；6：0.01ng/μL虎頭鯊DNA；7：DNA提取空白對照。

用草魚肉粉將虎頭鯊肉粉配制成10%、1%、0.1%和0.01%的肉粉樣品，并提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，10%、1%和0.1%的預(yù)混樣品DNA均出現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增條帶，0.01%預(yù)混樣品中未出現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增條帶（圖4）。

圖4 鯊魚肉粉（W/W）檢測靈敏度電泳圖注：M：DNA Marker DL2000；1：鯊魚陽性對照；2：陰性對照；3：10%虎頭鯊肉粉；4：1%虎頭鯊肉粉；5：0.1%虎頭鯊肉粉；6：0.01%虎頭鯊肉粉；7：DNA提取空白對照。

2.4 食品中鯊魚源性成分檢測的應(yīng)用

應(yīng)用該方法對市場上常見的鯊魚產(chǎn)品：鯊魚肉、干魚鰭、干魚翅、泡發(fā)魚翅、鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品、鯊魚軟骨素膠囊、鯊魚肝油、仿干魚翅和泡發(fā)仿魚翅樣品進(jìn)行檢測。其中，鯊魚肉、干魚鰭、干魚翅、泡發(fā)魚翅、鯊魚源硫酸軟骨素初級加工品、鯊魚軟骨素膠囊等含有鯊魚DNA的樣品中均能檢出鯊魚成分；而在未含鯊魚成分的仿干魚翅和泡發(fā)的仿魚翅中不能檢出，在精加工鯊魚肝油中不能檢出（圖5）。

圖5 鯊魚產(chǎn)品檢測電泳圖

3 結(jié)論與討論

以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)（如ELISA）和以核苷酸為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)（如PCR）目前已廣泛應(yīng)用于物種成分的鑒定。PCR檢測方法由于其高特異性和高靈敏度廣泛應(yīng)用于各種加工產(chǎn)品的基因檢測。但PCR檢測技術(shù)是基于DNA分子特殊片段完整性的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，食品精深加工過程中DNA不同程度的破壞會使食品中所含成分不能被檢出。鯊魚肝油是通過淡堿水解、離心、鹽洗、壓濾等一系列復(fù)雜加工過程而獲得的精加工產(chǎn)品[18]，其中的DNA得到很大程度的破壞，故該方法不能用于鯊魚肝油產(chǎn)品真實(shí)性的檢測。

目前還未見對鯊魚總類檢測的研究報道，即鯊魚真實(shí)性檢測鑒別。美國Shivji課題組對世界范圍內(nèi)海上捕獲最常見的鯊魚魚翅進(jìn)行種屬來源鑒別研究，使對各種鯊魚魚翅交易量的檢測成為可能[5]。巴西學(xué)者Danillo Pinhal等建立了基于5S rDNA基因序列的普通PCR方法，該方法能夠區(qū)別出8種鯊魚[19]。西班牙學(xué)者M(jìn).Blanco等運(yùn)用核苷酸測序的方法對所有可獲取的含鯊魚成分的海產(chǎn)品中所含鯊魚成分種屬來源進(jìn)行了研究，該方法適用于含鯊魚成分的加工海產(chǎn)品的鯊魚種類鑒別[20]。本實(shí)驗(yàn)室將上述方法依次應(yīng)用于9種供試鯊魚種類的檢測，結(jié)果表明所有方法均不能同時檢測出9種鯊魚種類（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

該檢測方法應(yīng)用于食品中鯊魚源性成分真實(shí)性檢測，DNA濃度靈敏度可達(dá)0.1ng/μL，鯊魚肉粉重量靈敏度可達(dá)0.1%，具有很高的可操作性和很強(qiáng)的實(shí)用性。除鯊魚肝油外，可廣泛應(yīng)用于市場上常見鯊魚產(chǎn)品的真實(shí)性檢測。全世界鯊魚種類共有359～370種，其中可食用的有20多種[21]。本研究供試鯊魚種類有9種，還沒有包括所有可食用的鯊魚種類，對食品中所有可食用鯊魚成分的檢測有待進(jìn)一步研究。

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Study on authentication of shark derived material in food using PCR

GUO Yun-xia1,2,BAO Jian-qiang1,ZHANG Shu-ya2,*,CHEN Ying3,HUANG Wen-sheng3,LV Rong2,LI Xiang2, GAO Qin2,LIU Yue-ming2
（1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China；2.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantine,Shanghai200135,China；3.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100025,China）

A specific and sensitive PCR method for identification of shark derived material in food was developed.A 180bp fragment was amplified form 9 kinds of shark samples，whereas no amplification was obtained from other 42 kinds of common plants and animals.The detection limit of the method was 0.1ng/μL DNA concentration and 0.1%（W/W）shark meat powder.20 commercial shark products samples were analysized by PCR and all the products indicated exist of shark DNA except the false shark fin and shark liver oil.The detection method can be used to the identification of shark derived material in food.

food；shark derived material；authentication；PCR

Q789

A

1002-0306（2011）10-0421-04

鯊魚，又名鮫、鮫鯊、沙魚，指軟骨魚綱板鰓亞綱鯊魚總目的魚類。鯊魚不但在維持海洋生態(tài)平衡方面起著重要作用，而且是對人類十分有益的經(jīng)濟(jì)魚類。鯊魚鰭加工制成的魚翅是價值較高的海產(chǎn)品之一，研究報道其富含膠原蛋白，有預(yù)防骨骼老化、防癌抗癌、滋補(bǔ)養(yǎng)顏、延年益壽等功效[1]。鯊魚軟骨中提取的鯊魚硫酸軟骨素不僅能降低血脂，防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病，而且還常用作保護(hù)關(guān)節(jié)的膳食補(bǔ)充劑[2]。鯊魚肝中提煉的鯊魚肝油富含多種維生素和多不飽和脂肪酸，是最理想的保健營養(yǎng)品。然而，一些不法商販為追求巨大的經(jīng)濟(jì)利益，將不含真魚翅成分的假魚翅標(biāo)成真魚翅出售，將其他動物成分加工成的硫酸軟骨素標(biāo)注成鯊魚硫酸軟骨素混入市場，極大地擾亂了市場秩序，侵害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，影響了國際貿(mào)易。為保證進(jìn)出口產(chǎn)品質(zhì)量和進(jìn)出口貿(mào)易的順暢流通，必須建立鯊魚類產(chǎn)品中鯊魚源性成分的真實(shí)性鑒別方法。國外對鯊魚類產(chǎn)品的研究主要集中在魚翅的鯊魚種屬來源鑒定[3-4]、魚翅貿(mào)易引起的世界范圍內(nèi)鯊魚種類和數(shù)量的變化[5-6]、世界范圍內(nèi)魚翅貿(mào)易的監(jiān)控和管理方法[7-9]以及鯊魚硫酸軟骨素和鯊魚肝油的生理保健功能和療效等[10-11]。國內(nèi)對鯊魚產(chǎn)品的研究主要有魚翅營養(yǎng)成分的提取和定量分析[12-13]、魚翅的加工工藝和仿魚翅的研制[14-15]以及鯊魚硫酸軟骨素的提取優(yōu)化和含量測定[16-17]。國內(nèi)外對食品中鯊魚源性成分真實(shí)性的鑒定方法研究都還很少。本研究應(yīng)用普通PCR技術(shù)，建立食品中鯊魚源性成分真實(shí)性快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。

2011-05-23 *通訊聯(lián)系人

郭云霞（1987-），女，碩士研究生，主要從事食品保鮮及分子生物學(xué)檢測技術(shù)研究。

國家質(zhì)檢總局科研項目（2010IK191）；出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定項目（2009B172）。