表沒食子兒茶素沒食子酸酯的提取分離工藝研究

郭秋韻，康麗紅，李 露，徐 昆，張學(xué)俊

（中北大學(xué)理學(xué)院，山西太原030051）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯的提取分離工藝研究

郭秋韻，康麗紅，李 露，徐 昆，張學(xué)俊

（中北大學(xué)理學(xué)院，山西太原030051）

采用無水乙醇對茶葉進(jìn)行浸提，用乙酸乙酯和蒸餾水分別對浸提液進(jìn)行萃取后濃縮包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin gallate，（-）-EGCG]在內(nèi)的黃酮類物質(zhì)。利用聚酰胺裝填的層析柱對茶葉中的（-）-EGCG進(jìn)行分離，并對分離產(chǎn)品結(jié)果進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)以活性炭為脫色劑，考察了活性炭的用量、脫色時(shí)間、脫色次數(shù)、脫色后溶液pH、乙酸乙酯與水的配比以及洗脫劑中乙醇濃度等條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。在各項(xiàng)條件最優(yōu)的情況下，每10g綠茶可以提取出純度大于98%的（-）-EGCG單體0.39g。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯，聚酰胺，活性炭，純度，產(chǎn)率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 安徽天方茶葉公司；聚酰胺 粒徑60～90目，江蘇臨江化工試劑廠；活性炭 粉末；乙酸乙酯 色譜純；（-）-EGCG標(biāo)準(zhǔn)品 長沙華欣科技公司；冰醋酸 優(yōu)級純；98%乙醇。

玻璃層析柱 規(guī)格500mm×20mm，定制；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 Waters 600型高效液相色譜儀（HPLC）；UV2300紫外分光光度儀 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀，POLAX-2L旋光儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多酚的浸提與分離 將10g茶葉在烤箱中進(jìn)行烘干后碾成碎末狀，在漏斗出口堵上脫脂棉后，將茶葉裝入恒壓滴液漏斗中，并向其中裝入無水乙醇。使用循環(huán)冷凝裝置并用水浴加熱，溫度在87℃左右。當(dāng)有冷凝液滴出時(shí)，開始計(jì)時(shí)，2h后，改換蒸餾裝置濃縮提取液。向提取液中加入活性炭粉末后進(jìn)行脫色，抽濾并收集濾液，用10%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)濾液的pH，再向其中加入一定比例的乙酸乙酯與水進(jìn)行萃取[6]，取上層油酯層并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙酸乙酯，干燥，得茶多酚粗品。

1.2.2 聚酰胺的預(yù)處理 將聚酰胺置于乙醇中攪拌，并進(jìn)行24h的浸泡處理，過濾后，濾餅每次使用20mL的乙醇沖洗3次（乙醇可回收并重復(fù)使用）。將處理好的聚酰胺倒入層析柱中，使聚酰胺自然沉降，放出柱內(nèi)多余的乙醇溶液，使液面略高于聚酰胺顆粒表面后關(guān)閉活塞，再分別用濃度為5%的NaOH溶液、10%的醋酸溶液洗滌[4]，最后用蒸餾水沖洗至流出液pH為7。

1.2.3 （-）-EGCG的分離與收集 將所得的茶多酚粗品加適量蒸餾水溶解后上聚酰胺柱。先用100mL蒸餾水洗脫，控制流速為4mL/min，當(dāng)層析柱內(nèi)液面略高于聚酰胺柱體高度時(shí)，使用一定濃度的乙醇—水溶液進(jìn)行洗脫，流速為3.0mL/min，至洗脫完全。將含（-）-EGCG的流份合并，回收乙醇，在40℃的溫度下進(jìn)行蒸發(fā)干燥，回收得（-）-EGCG固體粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 旋光度測定 在20℃的恒溫條件下，測定提取物的比旋光度，所得結(jié)果為[α]D=-172.0（c=1.0，乙醇）。

2.1.2 紅外光譜 如圖1所示，提取物的紅外光譜在1680cm-1處有一組較強(qiáng)的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1200～1240cm-1處有一組較強(qiáng)的C-O-C非對稱伸縮振動(dòng)吸收峰，在1450～1620cm-1處有苯環(huán)骨架特征振動(dòng)吸收峰，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道一致。

圖1 （-）-EGCG的紅外光譜圖

2.1.3 結(jié)構(gòu)分析 （-）-EGCG的分子構(gòu)型見圖2。（-）-EGCG是α-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有8個(gè)酚羥基。在通過聚酰胺柱層析時(shí)，分子的吸附能力與酚羥基的數(shù)目有關(guān)，數(shù)目越多，吸附力越強(qiáng)；同時(shí)，分子內(nèi)芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強(qiáng)。所以，與其他兒茶素中成分相比極性較強(qiáng)，（-）-EGCG與聚酰胺分子間的吸附力很強(qiáng)。通過（-）-EGCG的這一特殊性質(zhì)，可以利用聚酰胺柱層析法對其進(jìn)行純化。

圖2 （-）-EGCG的分子構(gòu)型

2.2 活性炭對（-）-EGCG脫色效果的影響因素分析

通過使用紫外光譜對用活性炭脫色后的溶液吸光度的測量[6]，同時(shí)參考（-）-EGCG的產(chǎn)率及純度，分析影響（-）-EGCG脫色效果的因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，A、B、C三因素對脫色效果影響的顯著性依次為B＞A＞C，其理論最優(yōu)水平則為A4B4C4，在此條件下溶液的吸光度為0.0142。

2.2.1 活性炭質(zhì)量的影響 隨著活性炭加入量增加，脫色效果逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)加入的活性炭達(dá)到一定量時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化較小。使用過量的活性炭會(huì)對溶液中（-）-EGCG產(chǎn)生吸附作用，致使目標(biāo)產(chǎn)物（-）-EGCG的產(chǎn)量下降。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性炭處于水平3時(shí)，脫色與產(chǎn)出的綜合效果最好。

2.2.2 脫色次數(shù)的影響 在對樣品分別進(jìn)行多次脫色后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)兩次脫色后的溶液吸光度基本不變。而脫色次數(shù)過多會(huì)造成活性炭的浪費(fèi)，同時(shí)在過濾分離的過程中產(chǎn)生（-）-EGCG的損耗，直接導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量的降低。故脫色次數(shù)處于水平2時(shí)，達(dá)到的脫色效果最佳。

2.2.3 脫色時(shí)間的影響 隨著時(shí)間的增加，脫色效果顯著增強(qiáng)，但當(dāng)脫色時(shí)間達(dá)到30min后，則脫色液中葉綠素含量吸收度變化不大。當(dāng)脫色時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致（-）-EGCG被活性炭吸附，從而使（-）-EGCG產(chǎn)量下降。

綜上所述，增大活性炭用量、增加脫色次數(shù)或延長脫色時(shí)間都會(huì)增加活性炭對產(chǎn)物的吸附，使產(chǎn)量下降；但減少活性炭用量、脫色次數(shù)及脫色時(shí)間則會(huì)導(dǎo)致茶多酚粗品的脫色不徹底，從而使實(shí)驗(yàn)終產(chǎn)物（-）-EGCG的純度不高。故實(shí)際所選取的最佳水平為A3B2C3，即分兩次對溶液進(jìn)行脫色，每次加入1.3g活性炭粉末，脫色時(shí)間為30min，此條件下脫色后溶液的吸光度為0.0149。

2.3 脫色后溶液不同pH對（-）-EGCG分離效果的影響

乙酸乙酯萃取前用檸檬酸調(diào)節(jié)濾液[7]，使反應(yīng)液達(dá)到不同pH。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集（-）-EGCG并精確稱量其產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。

圖3 pH對（-）-EGCG分離效果的影響

從圖3中可以看出，隨著pH的增加，提取效果增強(qiáng)，（-）-EGCG的產(chǎn)量增加，當(dāng)pH為4.0時(shí)，每10g茶葉中（-）-EGCG的產(chǎn)量達(dá)到最大值，約為0.39g；而當(dāng)pH＞4時(shí)，隨著pH的增加，提取效果逐漸變差。在調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)控制在4.0左右，這樣有利于（-）-EGCG的分離。

茶葉中含有包含咖啡堿在內(nèi)的各種堿性物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)pH來中和溶液中的堿性物質(zhì)，但當(dāng)pH過低即溶液酸度過大時(shí)，會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物（-）-EGCG分子中的酯鍵發(fā)生水解反應(yīng)，從而降低（-）-EGCG的產(chǎn)量。

2.4 萃取劑配比對萃取效果的影響

在萃取劑中水的體積不變并與溶液中乙醇的體積相同的情況下，將水與乙酸乙酯按不同比例配制后萃取反應(yīng)溶液。待靜置分層后取上層酯相，并用0.45μm的濾膜過濾，經(jīng)HPLC檢測，所得數(shù)據(jù)如表3。

在萃取過程中，溶液中的乙醇與萃取劑中的水、乙酸乙酯分別能夠完全互溶，而水與乙酸乙酯則存在部分互溶現(xiàn)象。隨著三組分比例不同，平衡時(shí)兩液相的組成也相應(yīng)發(fā)生變化。在溶液中乙醇體積不變的情況下，隨著乙酸乙酯所占比例的增加，乙醇中的（-）-EGCG逐漸向溶解度較大的乙酸乙酯中移動(dòng)，從而達(dá)到萃取濃縮的目的；但當(dāng)乙酸乙酯比例進(jìn)一步增加時(shí)，體系中的水也同時(shí)開始與乙酸乙酯互溶，兩液相組成越來越接近，甚至在某一點(diǎn)時(shí)可以形成同一液相，從而對后面的分離過程造成困難。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)水與乙酸乙酯的配比為1∶3時(shí)，萃取的效果最好。

表3 萃取劑配比對萃取效果的影響

2.5 流動(dòng)相組成對分離效果的影響

乙醇和水的混合液的流動(dòng)相[8]中，分別取乙醇所占的體積比為50%、60%、70%、80%、90%、100%進(jìn)行分離。六次所得酯相均經(jīng)HPLC檢測[9]，以體積比為橫坐標(biāo)，以（-）-EGCG的峰高與表兒茶素（EC）峰高的比值為縱坐標(biāo)作圖。由圖可得，乙醇的體積比為90%時(shí)的分離效果最好。

圖4 流動(dòng)相對EGCG分離效果的影響

3 結(jié)論

3.1 每10g茶葉使用總量為2.6g的活性炭，分兩次進(jìn)行脫色，每次脫色時(shí)間為30min，所得茶多酚粗品的脫色效果最好。

3.2 脫色后溶液的pH、水與乙酸乙酯的配比及洗脫劑中乙醇的濃度對（-）-EGCG產(chǎn)量及純度有明顯影響，當(dāng)萃取液的pH為4.0，水與乙酸乙酯的配比為1∶3，流動(dòng)相中乙醇含量為90%時(shí)所得結(jié)果最好。

[1]王洪新，戴軍，張家驪，等.茶葉兒茶素單體的分離純化及鑒定[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（2）:117-121.

[2]丁平平.茶多酚及兒茶素單體（-）-EGCG的分離制備研究[D].成都：四川大學(xué)，2006：26-40.

[3]戚向陽，謝筆鈞，胡慰望.高純度表沒食子兒茶素沒食子（（-）-EGCG）的分離與制備[J].精細(xì)化工，1994，11（4）:40-46.

[4]王傳金，魏運(yùn)洋，朱廣軍，等.聚酰胺色譜法分離制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯[J].應(yīng)用化學(xué)，2007，24（4）：443-447.

[5]唐課文，周春山，鐘世安，等.聚酰胺樹脂對茶多酚和咖啡因吸附選擇性的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2003（2）:143-145.

[6]王傳金，魏運(yùn)洋，張小赫.綠茶提取物脫色除雜方法的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（4）:1117-1118.

[7]楊性民，劉青梅，高海月，等.茶多酚中（-）-EGCG分離純化工藝優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報(bào)，2006，6（5）：77-80.

[8]張星海，郭碧花，沈生榮.兒茶素富集和（-）-EGCG單體純化新工藝研究[J].茶葉，2002，28（3）:136-137.

[9]王 霞，高麗娟，林炳昌.表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-EGCG）的分離與制備[J].食品科學(xué)，2005，26（9）:242-247.

Study on extraction and separation of epigallocatechin gallate

GUO Qiu-yun,KANG Li-hong,LI Lu,XU Kun,ZHANG Xue-jun
（Department of Science,North University of China,Taiyuan 030051,China）

Using anhydrous alcohol to extract of tea，and using ethyl acetate and distilled water to soak mention fluid respectively to extract enrichment flavonoids substances which contains epigallocatechin gallate.Then using polyamide chromatography column in the(-)-EGCG separation，and analysis the results.The active carbon was used as decoloring agents，at the same time to examine the dosage of activated carbon，decoloring time and decoloring number，the pH of bleaching solution，the proportion of ethyl acetate and water and the ethanol concentration of elution agents which had influence on experimental results.In the conditions of optimal，each 10g green tea could extract the(-)-EGCG monomer about 0.39g which purity was higher than 98%.

epigallocatechin gallate；polyamide；activate carbon；purity；yield

TS272

B

1002-0306（2011）10-0358-04

兒茶素是茶葉中含量豐富且功能重要的一類物質(zhì)，其成分主要包括表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-EGCG]等，而（-）-EGCG是兒茶素中最有效的活性成分，約占綠茶毛重的8%～13%，也是兒茶素中含量最高的組分[1]。（-）-EGCG是α-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，具有酚類抗氧化的通性，其分子結(jié)構(gòu)中有6個(gè)鄰位的酚羥基，因此有優(yōu)于其它兒茶素的許多性質(zhì)。并具有抗菌消炎、抗氧化和抗突變的作用，也可用作為腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠改善癌細(xì)胞對化療的敏感性，減輕對心臟的毒性，還有保護(hù)內(nèi)皮的作用，可以有效促進(jìn)血管舒張，減少心血管疾病的發(fā)生[2]。高純度（-）-EGCG與茶多酚提取物相比，具有有效成分明確、沒有雜質(zhì)副作用干擾、活性更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此分離純化（-）-EGCG具有重要意義。目前，（-）-EGCG的主要分離方法主要有HPLC分離、葡萄糖凝膠分離、超臨界流體萃取、柱層析法等[2-3]。由于吸附型填料價(jià)格便宜，具有吸附能力強(qiáng)、解吸容易、穩(wěn)定性高、可再生、反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，本文在前人的研究基礎(chǔ)上，使用聚酰胺為柱色譜填料，對茶葉中（-）-EGCG的分離、純化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2010-11-15

郭秋韻（1990-），女，本科生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取與分離。