正交試驗(yàn)法優(yōu)選桑菊飲水煎煮工藝研究

金仲達(dá) 朱惠中 趙勁草

（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬常熟第一人民醫(yī)院，江蘇 常熟 215500）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選桑菊飲水煎煮工藝研究

金仲達(dá) 朱惠中 趙勁草

（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬常熟第一人民醫(yī)院，江蘇 常熟 215500）

目的優(yōu)選桑菊飲最佳水煎煮工藝。方法以蘆丁、綠原酸、浸出物含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，考察浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量四個(gè)因素，對(duì)桑菊飲的水煎煮工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果最佳水煎煮工藝為：浸泡30分鐘，加飲片總量8倍量水，煎煮2次，每次30min。結(jié)論優(yōu)選得到的最佳水煎煮工藝穩(wěn)定、合理。

桑菊飲；蘆??；綠原酸；水煎煮工藝；正交試驗(yàn)

桑菊飲是一劑辛涼解表傳統(tǒng)湯劑，出自《溫病條辨》卷一，由桑葉、菊花、杏仁、薄荷等八味藥組成。具有宣肺止咳、疏風(fēng)清熱的功能，常用于外感風(fēng)熱、咳嗽初起之證，臨床療效確切[1]。中藥湯劑是中藥的傳統(tǒng)劑型之一，湯劑質(zhì)量的好壞直接影響到臨床療效，湯劑影響療效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是湯劑中煎出的有效成分，因此要發(fā)揮中藥湯劑的臨床療效，必須要盡最大限度的煎出有效成分。2010版中國(guó)藥典中桑葉、菊花的含量測(cè)定項(xiàng)下分別以蘆丁、綠原酸為指標(biāo)，用高效液相色譜法測(cè)定其含量。在本方中桑葉、菊花為君藥，其主要有效成分分別為蘆丁、綠原酸。蘆丁具有抗炎、抗病毒等作用[2]，綠原酸是菊花發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。因此選擇蘆丁、綠原酸為指標(biāo)，采用高效液相色譜法并運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳的工藝條件。

目前，自煎藥機(jī)1996年從韓國(guó)進(jìn)入我國(guó)，其優(yōu)于傳統(tǒng)煎煮的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已普遍被大家所接受[4,5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金仁達(dá)[6]等按相同加水量，提取時(shí)間等對(duì)黃芩、金銀花、黃柏等進(jìn)行提取，以藥材中的標(biāo)志性成分作定量指標(biāo)，結(jié)果證明在相同時(shí)間內(nèi)，煎藥機(jī)煎煮中藥成分溶出率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)砂鍋。同時(shí)證明，第2次提取仍有60%～80%的溶出量，提示目前臨床廣泛采用煎藥機(jī)一次煎藥法欠妥。本實(shí)驗(yàn)綜合了各方面因素，通過(guò)煎藥機(jī)煎煮優(yōu)選出了桑菊飲最佳水煎煮工藝，為制訂一套針對(duì)不同煎煮要求復(fù)方湯劑的規(guī)范化煎煮工藝提供參考，指導(dǎo)臨床合理有效用藥，滿足臨床要求。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；LC-10ADVP型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SPD-10AVP紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；電子天平（FA1104）；KQ-500B型超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器；YFY20煎藥機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司）。

試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、水（重蒸水），其他試劑均為分析純；對(duì)照品：蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200306）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200413）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用。桑葉、菊花、薄荷等飲片均購(gòu)于安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，并由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，對(duì)浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量進(jìn)行考察，設(shè)定煎藥機(jī)溫度為110℃，壓力0.12MPa。以蘆丁、綠原酸和浸出物得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行提取工藝最佳參數(shù)的確定。提取工藝因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。按處方配比取桑葉、菊花、薄荷等共9份，每份按照正交實(shí)驗(yàn)因素水平表操作，過(guò)濾后將所得的濾液減壓濃縮成稠膏，備用。以判斷各因素對(duì)提取效果的影響程度，篩選出在該實(shí)驗(yàn)條件下最優(yōu)的提取條件，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3～5。

表1 水煎煮因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 蘆丁方差分析表

表4 綠原酸方差分析表

表5 水提浸出物方差分析表

2.2 蘆丁的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），洗脫程序：0～5min，A為30%；5～10min，A為30%～35%，10～15min，A為35%～40%，15～18min，A為40%～50%；18～20min，A為50%～30%。檢測(cè)波長(zhǎng)：358nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫：30 ℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.0639mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取約相當(dāng)于1g桑葉飲片的稠膏，精密稱定，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾渣再用甲醇50mL，同法提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.0639mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛确謩e為3.195、6.39、9.585、12.78、15.9755、19.17μg/mL。分別吸取上述各對(duì)照品溶液10μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y＝16.62X-16.473，r=0.9997（n=6）。結(jié)果表明：蘆丁進(jìn)樣量在3.195～19.17μg范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.2.5 樣品中蘆丁含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液（濃度分別為：0.003195mg/mL，0.01917mg/mL）以及各供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣2次，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，測(cè)定各樣品中蘆丁的含量。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.3 綠原酸含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），洗脫程序：0～13min，A為10%～18%；13～30min，A為18%～20%，30～40min，A為20%。檢測(cè)波長(zhǎng)：348nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫：30℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，置于10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.085mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取相當(dāng)于0.5g菊花飲片的稠膏適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率45kHz）40min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.085mg/mL綠原酸對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.16、0.3、0.4mL，分別置于1mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛确謩e為4.25、8.5、13.6、17、25.5μg/mL分別吸取上述各對(duì)照品溶液10μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y＝14.079X-4.4328，r=0.9995（n=5）。結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在4.25～25.5μg范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.3.5 樣品中綠原酸含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液（濃度分別為：4.25 μg/mL，25.5μg/mL）及各供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣2次，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，測(cè)定各樣品中綠原酸含量。結(jié)果見(jiàn)表2、表4。

2.4 浸出物得率測(cè)定

精密稱取各實(shí)驗(yàn)號(hào)樣品稠膏2g，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，于105 ℃烘箱中干燥3h，取出置干燥器內(nèi)冷卻30min，迅速精密稱重，計(jì)算浸出物得率。結(jié)果見(jiàn)表2、表5。

結(jié)果表明，B因素對(duì)綠原酸的含量具有極顯著性影響，C因素對(duì)浸出物的含量具有極顯著性影響，其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)明顯影響。綜合蘆丁、綠原酸含量及水提浸出物得率的方差分析結(jié)果，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用中病人口服劑量、降低成本、節(jié)約時(shí)間等因素，最終確定最佳水煎煮工藝為：飲片浸泡30min，加飲片總量8倍量水，煎煮2次，每次30min。

2.6 最佳水煎煮工藝條件的驗(yàn)證

按處方比例取桑葉、菊花、薄荷等各3份，按最佳水煎煮工藝進(jìn)行水煎煮，即飲片浸泡30min，加飲片總量8倍量水，煎煮2次，每次30min。合并水提液，濃縮至浸膏，取樣測(cè)定浸膏中蘆丁、綠原酸含量及浸出物得率，測(cè)定方法和供試品溶液的制備方法與水提正交樣品相同。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 水煎煮工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表6可見(jiàn)，3次試驗(yàn)所測(cè)得的蘆丁、綠原酸及浸出物含量與最佳工藝所測(cè)得的平均含量相近，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討 論

3.1 該煎煮方屬于解表方，因此在水煎煮過(guò)程中，煎煮時(shí)間為關(guān)鍵因素。時(shí)間過(guò)短，苦杏仁等不易煎出，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致有效成分尚失，達(dá)不到臨床療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30min水煎煮的綠原酸的含量最高。

3.2 《中國(guó)藥典》中桑葉藥材含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫，但是在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不出峰，通過(guò)預(yù)試，將流動(dòng)相中甲醇和水的比例作了適當(dāng)調(diào)整，最終確定了該實(shí)驗(yàn)中的條件，該條件下分離效果較好。

3.3 該實(shí)驗(yàn)為在應(yīng)用煎藥機(jī)煎煮的基礎(chǔ)上，相關(guān)參數(shù)的設(shè)定，如浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等有了個(gè)具有說(shuō)服力的比較研究。在進(jìn)一步推廣中藥煎藥機(jī)的道路上，未來(lái)的研究方向不能僅僅局限于傳統(tǒng)煎煮法與煎藥機(jī)煎煮法的比較，或者局限于單藥的煎煮條件研究，而應(yīng)該針對(duì)不同煎煮要求的復(fù)方湯劑，在煎藥機(jī)煎藥的工藝條件改進(jìn)上做進(jìn)一步的研究，制訂一套針對(duì)不同煎煮要求復(fù)方湯劑的規(guī)范化煎煮工藝，以求取得理想的臨床療效。

[1] 蔣玉珍.從桑菊飲、銀翹散的組方探討辛涼解表劑的配伍結(jié)構(gòu)[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,10(2):67.

[2] 蒲秋燕,張艷艷,黃平.桑葉的研究現(xiàn)狀[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào),2011(5):7.

[3] 李永霞.湖北產(chǎn)不同品種菊花中綠原酸的含量測(cè)定[J].湖北中醫(yī)雜志,2006,28(2):48-49.

[4] 李毅民,許麗雯,章崇儀,等.機(jī)器與傳統(tǒng)方法煎藥效果的比較[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,1999,19(11):697.

[5] 梁衛(wèi)青,鄭軍獻(xiàn),浦錦寶,等.煎藥機(jī)煎藥與傳統(tǒng)方法煎藥檢出率的比較[J].浙江中醫(yī)雜志,2005,40(9):404.

[6] 金仁達(dá).中藥煎藥機(jī)對(duì)中藥有效成分溶出的研究[J]基層中藥雜志,1999,13(2):41.

R282.710.2

B

1671-8194（2011）32-0288-03

常熟市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目，正交設(shè)計(jì)優(yōu)選不同煎煮要求復(fù)方的煎藥工藝研究（編號(hào)CS200920）