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    高糖環(huán)境下HGF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1 的影響

    2011-11-01 03:57:04王保忠
    關(guān)鍵詞:分泌量系膜甘露醇

    王保忠

    糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,腎小球系膜細(xì)胞(MsC)功能的研究對(duì)闡明DN發(fā)病機(jī)制具有重要意義。近年研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)在DN發(fā)病機(jī)制中起重要作用。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)能有效抑制與慢性腎臟疾病及慢性腎功能衰竭密切相關(guān)的腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展過(guò)程。本研究以大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)為靶細(xì)胞,用高糖誘導(dǎo)造成體外培養(yǎng)的RMC功能紊亂,觀察RMC的增殖情況、TGF-β1的分泌變化以及 HGF干預(yù)作用,以闡明HGF對(duì)糖尿患者腎臟可能具有的保護(hù)作用,為DN的防治提供新的思路。

    1 資料與方法

    1.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)的培養(yǎng)與處理 RMC常規(guī)復(fù)蘇后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)2~3 d,用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代。RMC由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

    1.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖 將RMC接種于96孔板,按以下分組給藥:①正常對(duì)照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,葡萄糖終濃度5.5 mmol/L),②高糖組(DMEM培養(yǎng)液中加入D-葡萄糖,葡萄糖終濃度25.0 mmol/L),③高糖+HGF組(25.0 mmol/L葡萄糖,50 ng/ml HGF),加入相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時(shí)間(12,24,48,96 h),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后每孔加入25 μlMTT(5 mg/ml)溶液,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加入100 μl二甲基亞楓(DMSO),振蕩30 min后于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)光吸收(OD)值。OD值越大,表明細(xì)胞增殖越旺盛。

    1.3 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)測(cè)細(xì)胞上清液中TGF-β1水平 (1)TGF-β1分泌檢測(cè)分組:將RMC接種于96孔培養(yǎng)板中,分為3組:①正常對(duì)照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L);②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L),甘露醇對(duì)照組 (20.0mmol/L甘露醇,使其滲透壓與高糖組相同)。分別于培養(yǎng)的12、24、48、96 h收集細(xì)胞,用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)檢測(cè)TGF-β1分泌量。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。另外將RMC分為:①正常對(duì)照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L),②高糖組(葡萄糖濃度25.0mmol/L)③高糖+HGF組(葡萄糖濃度25.0mmol/L,HGF濃度分別為25、50、100、200ng/ml)。分別培養(yǎng)48 h后,用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)測(cè)定此時(shí)TGF-β1分泌情況。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。(2)按照TGF-β1/ELISA試劑盒(由上海生物工程公司提供)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,最終于酶標(biāo)儀450nm處測(cè)(OD)值。大鼠TGF-β1的濃度與OD值成正比。根據(jù)TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)品A值曲線y=ymax×x^n/(k^n+x^n),換算所測(cè)上清液中TGF-β1的含量。

    2 結(jié)果

    2.1 高糖和HGF對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 12 h時(shí)間點(diǎn)各組間細(xì)胞增殖均無(wú)顯著性差異。24 h時(shí)間點(diǎn),高糖組較正常對(duì)照組相比促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05),高糖+HGF組較高糖組相比,可以抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)。48,72和96 h時(shí)間點(diǎn),高糖組較正常對(duì)照組相比細(xì)胞增殖受抑(P<0.05)。高糖+HGF組較高糖組相比促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)。而且呈時(shí)間依賴性,(見(jiàn)表1)。

    2.2 高糖對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1分泌的結(jié)果 高糖組TGF-β1分泌量從24 h開(kāi)始升高,持續(xù)至96 h達(dá)到高峰。甘露醇組同樣出現(xiàn)TGF-β1分泌,作用24 h后同對(duì)照組相比存在差異(P<0.05)。但同高糖組相比,甘露醇組的表達(dá)量又遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高糖組(P<0.05)。在96 h,甘露醇組與對(duì)照組相比沒(méi)有差異(P>0.05)。說(shuō)明甘露醇組并沒(méi)有促進(jìn)TGF-β1分泌,(見(jiàn)表2)。

    2.3 高糖和HGF對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1分泌的結(jié)果 高糖組中TGF-β1分泌量較高,HGF組與高糖組相比,TGF-β1分泌量明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且呈劑量依賴性,(見(jiàn)表3)。

    表1 高糖與HGF作用下腎小球系膜細(xì)胞的增殖(OD值)(n=6)

    表2 高糖作用下腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1的分泌量(n=6 ng/ml)

    表3 高糖TG與F-βHGF作用下腎小球系膜細(xì)胞1的分泌量(n=6)

    3 討論

    DN是糖尿病患者常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,其主要的病理變化為腎小球肥大,ECM產(chǎn)生增多。MsC是腎小球內(nèi)產(chǎn)生ECM的主要固有細(xì)胞,在DN發(fā)病過(guò)程中不僅是被動(dòng)受害者,而且也是直接參與者,通過(guò)其自身代謝和功能改變直接影響DN進(jìn)程。細(xì)胞因子在DN的發(fā)病中起著重要的作用。TGF-β1是唯一對(duì)ECM形成具有廣泛調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。HGF主要由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。腎臟是HGF表達(dá)最高的臟器。HGF能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能如細(xì)胞的生存,增殖,遷移以及分化。

    有研究證實(shí),采用抗TGF-β1抗體抑制TGF-β1的合成可以緩解腎臟纖維化的程度[1]。進(jìn)一步說(shuō)明TGF-β1在腎臟纖維化中的重要性。本實(shí)驗(yàn)也同樣證實(shí),高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌TGF-β1,于高糖作24 h開(kāi)始合成增加,并且隨著高糖持續(xù)作用,TGF-β1呈現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)。同時(shí)我們對(duì)滲透壓因素進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果證實(shí),高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的改變可能部分是由于滲透壓因素所致,然而高糖誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)TGF-β1,并不完全依賴滲透壓介導(dǎo)。說(shuō)明高糖本身就可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷。因此,本研究在體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞,將高糖作為一個(gè)重要因素進(jìn)行誘導(dǎo)刺激,部分模擬了體內(nèi)糖尿病環(huán)境。

    近年來(lái)研究表明,減少ECM的積聚,拮抗細(xì)胞因子的不良作用,抑制MsC的增殖活化已成為防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)[2]。在正常組織中,TGF-β1和HGF處于一種互逆平衡狀態(tài)。在病理狀態(tài)下,若HGF占優(yōu)勢(shì)則利于損傷修復(fù);若TGF-β1占優(yōu)勢(shì)則組織出現(xiàn)纖維化改變[3]。Cruzado等[4]發(fā)現(xiàn)HGF基因治療降低了進(jìn)展期 DN的蛋白尿,緩解了系膜增多和腎小球硬化。與其能遏止系膜區(qū) TGF-β1和結(jié)締組織因(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)早期,細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生TGF-β1高表達(dá)。高糖作用晚期,TGF-β1表達(dá)開(kāi)始增加。加入HGF可以降低TGF-β1的分泌。局部HGF水平降低以及TGF-β1表達(dá)升高,可能共同參與了腎臟纖維化過(guò)程[5,6]。本研究證實(shí) HGF可以直接抑制 TGF-β1的分泌,并且存在劑量依賴性抑制作用,隨著HGF劑量的增加,其抑制TGF-β1表達(dá)的作用也更顯著。另外,有其他相關(guān)研究證實(shí),HGF還可以通過(guò)抑制纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)表達(dá)[7]使ECM合成減少,來(lái)預(yù)防ECM沉積。從上述結(jié)果可以看出HGF和TGF-β1生物活性是相反的。

    綜上所述,高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1出現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá),而給予外源性的HGF后,系膜細(xì)胞TGF-β1的分泌減少,而且呈時(shí)間依賴性。我們將在以后的研究中進(jìn)一步闡明HGF在介導(dǎo)DN發(fā)病中的具體機(jī)制,為DN防治提供新途徑。

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