人單鏈白細(xì)胞介素12的原核表達(dá)和生物學(xué)活性鑒定＊

周鶴峰，邵 敏，姬可平，葛正龍

（1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041；2.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563003）

人單鏈白細(xì)胞介素12的原核表達(dá)和生物學(xué)活性鑒定＊

周鶴峰1，邵 敏1，姬可平1，葛正龍2△

（1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519041；2.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563003）

目的 構(gòu)建含人單鏈白細(xì)胞介素12（hscIL－12）基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)具有活性的hscIL－12。方法 PCR法從質(zhì)粒pCA13－h(huán)scIL－12中擴(kuò)增hscIL－12基因，經(jīng)酶切、連接構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a（＋）－h(huán)scIL－12，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，用異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，經(jīng)鎳柱親和層析（Ni2＋－NTA）純化，體外增殖實驗檢測其生物學(xué)活性。結(jié)果 PCR擴(kuò)增、雙酶切及DNA序列測定證實pET28a（＋）載體上成功插入了hscIL－12基因片段。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE電泳分析，證明其相對分子質(zhì)量為70×103；蛋白質(zhì)印記表明重組蛋白具有hscIL－12抗原活性；表達(dá)產(chǎn)物純化、復(fù)性后進(jìn)行體外生物學(xué)活性實驗表明，該重組蛋白能刺激外周血單核細(xì)胞（PBMC）產(chǎn)生IFN－γ。結(jié)論 pET28a（＋）－h(huán)scIL－12原核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組hscIL－12蛋白的制備為進(jìn)一步研究hscIL－12生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

人單鏈白細(xì)胞介素12；大腸桿菌；生物學(xué)活性；表達(dá)

白細(xì)胞介素12（interleukin 12，IL－12）又名自然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF），或稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子（CLMF），它是由抗原呈遞細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性細(xì)胞因子。它能促進(jìn)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)干擾素（IFN）－γ等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化發(fā)育，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗病毒、抗感染的作用［1］。IL－12是由P40和P35兩個亞基通過二硫鍵構(gòu)成的異二聚體細(xì)胞因子［2］，只有當(dāng)這兩個亞基形成異源二聚體時，IL－12分子才具有生物活性［3］，單個P40或P35亞基的過量表達(dá)還會產(chǎn)生活性抑制作用［4］。本實驗使用的人單鏈IL－12（human single chain IL－12，hscIL－12）全長基因由編碼P40和P35的2個基因經(jīng)一段接頭序列連接而成，用其構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并獲得了有活性的重組hscIL－12，為進(jìn)一步研究hscIL－12生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 質(zhì)粒 pCA13－h(huán)scIL－12、原核表達(dá)載體pET28a（＋）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本室保存。

1.1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；高保真即用PCR擴(kuò)增試劑盒、UNTQ－10柱式DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；鎳離子親和層析柱（Ni2＋－NTA）購自Qiagen公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒試劑盒購自武漢博士德公司；鼠抗人IL－12單克隆抗體購自R＆D公司；羊抗鼠IgG－辣根過氧化物酶（HRP）購自武漢博士德公司；IL－12國際標(biāo)準(zhǔn)品、人IFN－γ酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自R＆D公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 寡核苷酸引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中hsdlL－12的cDNA序列設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司完成。上游引物：5′－CTAGCT AGCATG GGT CAC CAG CAG T－3′（劃線部分為NheⅠ酶切位點），下游引物：5′－ACCGGAG CTCTTA GGA AGC ATT CAG－3′（劃線部分為SacⅠ酶切位點）。

1.2 方法

1.2.1 hscIL－12的 PCR 擴(kuò)增 以質(zhì)粒pCA13－h(huán)scIL－12為模板，在50μL反應(yīng)體系中，加入上、下游引物各3μL，模板pCA13－h(huán)scIL－12 1μL，2×PCR Master 25μL，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性10min，94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)，72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定［5］PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a（＋）分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SacⅠ雙酶切后，用回收試劑盒回收，連接回收的目的基因與原核表達(dá)載體片段，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)增并小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。鑒定陽性的菌株送上海生工進(jìn)行生物工程公司測序。

1.2.3 hIL－12蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。將陽性克隆接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD（600）為0.5，經(jīng)異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），終濃度為1mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h［6］，菌液離心棄上清，超聲裂解菌體，收集上清及裂解物沉淀行SDS－PAGE電泳。徹底溶解裂解物沉淀，用鎳柱親和層析法Ni2＋－NTA純化目的蛋白，按照Qiagen公司Ni2＋－NTA使用說明書進(jìn)行，純化蛋白經(jīng)過透析復(fù)性，SDS－PAGE電泳和薄層掃描分析蛋白純度，對蛋白進(jìn)行凍干保存準(zhǔn)備用于活性檢測。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡分析 將上述誘導(dǎo)后的裂解菌液進(jìn)行SDS－PAGE電泳后，參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌；與一抗室溫反應(yīng)2h，PBS洗滌；與HRP標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)2h，洗滌；用ECL試劑室溫孵育1min，進(jìn)行暴光、顯影和定影。以未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解液和用空載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌誘導(dǎo)物作對照。

1.2.5 重組蛋白生物學(xué)活性測定 分離人外周血單個核細(xì)胞（PBMC），用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×106個/mL，向96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL。將標(biāo)準(zhǔn)品用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成2ng/mL，原核表達(dá)的不同濃度的重組hscIL－12蛋白，分別按每孔100μL加入含有細(xì)胞懸液的96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，收集上清液用ELISA試劑盒測定IFN－γ的含量，操作步驟按試劑盒說明書完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體 pET28a（＋）－h(huán)scIL－12的鑒定 以質(zhì)粒pCA13－h(huán)scIL－12為模板，PCR擴(kuò)增hscIL－12cDNA。將hscIL－12克隆入pET28a（＋）中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a（＋）－h(huán)scIL－12，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增和 NheⅠ、SacⅠ雙酶切鑒定，可見大小約1 600bp的條帶，經(jīng)測序證實結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，見圖1。

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 將重組基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲裂解后，對全菌裂解液進(jìn)行SDS－PAGE分析，相對分子量為70×103的外源蛋白表達(dá)水平大大提高，該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量與hscIL－12融合蛋白理論相對分子質(zhì)量一致，見圖2，鎳柱親和層析后獲得了純度在95%以上的hscIL－12蛋白。

2.3 重組蛋白質(zhì)印跡鑒定 蛋白質(zhì)印跡分析表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體裂解液能與抗體發(fā)生特異反應(yīng)，經(jīng)ECL顯色，曝光，膠片上在相對分子質(zhì)量為70×103處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，見圖3，與目的蛋白帶一致，而空載體未見顯色反應(yīng)。

圖1 pET28a（＋）－h(huán)scIL－12的PCR和酶切鑒定

圖2 pET28a（＋）－h(huán)scIL－12在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)的SDS－PAGE分析

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)菌體的蛋白質(zhì)印跡分析

2.4 hscIL－12生物活性測定 以濃度為5ng/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和濃度分別為2、4和6ng/mL的重組hscIL－12蛋白作用于人PBMC，同時以PBS作為對照，檢測IFN－γ表達(dá)量分別為（712.5±37.5）pg/mL、（243.8±11.9）pg/mL、（467.6±32.1）pg/mL、（746.2±39.5）pg/mL，PBS對照組表達(dá)量為（21.5±8.6）pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，標(biāo)準(zhǔn)品和不同濃度梯度原核表達(dá)的hscIL－12分別與PBS空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明原核表達(dá)的hscIL－12能夠促進(jìn)PBMC產(chǎn)生IFN－γ，證明重組原核表達(dá)載體能夠表達(dá)有生物活性的hscIL－12。

3 討 論

IL－12是一種重要的細(xì)胞因子，由P40和P35 2個亞基經(jīng)二硫鍵共價結(jié)合而成的異源二聚體［8］。一級結(jié)構(gòu)P40有306個氨基酸，含4個理論糖基化位點和10個半胱氨酸；P35有197個氨基酸，含3個理論糖基化位點和7個半胱氨酸［9］。hs IL－12是一個多功能的免疫調(diào)節(jié)因子，具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的作用［10］，而且不良反應(yīng)小。

提高蛋白表達(dá)量的首要因素，是選擇適合的載體與宿主菌［11］。本研究選用了T7表達(dá)系統(tǒng)中的pET28a表達(dá)載體。pET系列載體以T7為啟動子，可使目的基因得到高效轉(zhuǎn)錄與翻譯。由于該表達(dá)系統(tǒng)在目的表達(dá)產(chǎn)物的N端融合了一段6個組氨酸標(biāo)簽序列，有利于天然條件下用金屬鰲合層析進(jìn)行融合蛋白的純化，本實驗使用Ni2＋－NTA純化目的蛋白，Ni2＋與組氨酸結(jié)合，在純化過程中分辨率高、選擇性好、操作方便，可獲得的重組蛋白純度高。而組氨酸標(biāo)簽相對分子質(zhì)量小，無生物活性，一般對重組蛋白的功能無影響。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量高，容易純化，且具有遺傳背景清楚、成本低、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)等特點［12］。

本實驗成功將hscIL－12克隆入原核表達(dá)載體pET28a（＋）中，在大腸桿菌BL21（DE3）獲得高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在，包涵體的形成，可使在胞內(nèi)表達(dá)的外源蛋白不易被細(xì)菌的蛋白酶所降解，同時也有利于重組蛋白的分離純化。包涵體經(jīng)過洗滌、溶解、Ni2＋－NTA純化以及蛋白質(zhì)的復(fù)性等步驟后，獲得了純度約為95% 的重組hscIL－12蛋白，蛋白質(zhì)印跡表明重組蛋白具有hscIL－12抗原活性。經(jīng)純化、復(fù)性后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行體外實驗表明，表達(dá)hscIL－12能刺激PBMC產(chǎn)生IFN－γ，提示該重組蛋白具有生物學(xué)活性。本研究成功實現(xiàn)hscIL－12蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)，為其進(jìn)一步的理論研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and bioactivity identification of single chain human interleukin－12＊

Zhou Hefeng1，Shao Min1，Ji Keping1，Ge Zhenglong2△
（1.Department of Bioengineering，Zhuhai Campus，Zunyi Medical College，Zhuhai，Guangdong519041，China；2.Department of Biochemistry，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou563003，China）

Objective To construct the expression vector of human single chain interleukin－12（hscIL－12）gene.It can express hscIL－12with bioactivity in escherichia coli.Methods hscIL－12gene was amplified from recombinant pCA13－h(huán)scIL－12.With restricted enzyme digestion，gene of interest was cloned into the prokaryotic vector pET28a（＋）to construct expressing plasmid of pET28a（＋）－h(huán)scIL－12.After pET28a（＋）－h(huán)scIL－12was transformed into escherichia coli BL21（DE3），the bacteria were induced by IPTG.The expression of hscIL－12was detected by Western bloting.The hscIL－12protein was purified by Ni－NTA affinity chromatography.The bioactivity of hscIL－12was detected by PHA－activated peripheral blood mononuclear cell（PBMC）proliferation assay.Results PCR and restriction enzyme digestion and DNA sequencing indicated that hIL－12gene was inserted into the procaryotic expression vector pET28a（＋），SDS－PAGE analysis showed that molecular weight of the expressed protein was 70×103；Western blotting analysis showed that recombinant protein had the antigenicity of hscIL－12.The purified hscIL－12protein had the bioactivities in stimulating the IFN－γproduction of human PBMC.Conclusion The construction of the recombinant plasmid and the preparation of the active protein of hscIL－12have laid a foundation for further studying the function and clinical applications of hscIL－12.

interleukin－12；escherichia coli；bioactivity；expression

10.3969/j.issn.1671－8348.2011.31.002

A

1671－8348（2011）31－3124－03

貴州省科委重大攻關(guān)項目（2004NGZ002）；貴州省教育廳重點項目（2004118）?！?/p>

，Tel：（0852）8608572；E－mail：zbngge@hotmail.com。

2011－05－09

2011－07－14）